一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法

摘要

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法。该分离方法包括：用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO₂培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。上述培养方法包括：对培养皿进行包被处理，弃去明胶，用PBS缓冲液进行洗涤；将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于培养皿中；待细胞生长融合至80%‑90%时进行消化传代。

主权项

一种脐带间充干细胞的分离方法，其包括以下步骤：(1)用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；(2)将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉，将剥离的华通氏胶均匀剪碎，加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO₂培养箱中消化处理；所述胶原酶A的浓度为1mg/mL‑3mg/mL，胶原酶A的添加量为每根10‑15cm脐带添加15mL，消化处理的时间为2‑4小时；胶原酶A与中性蛋白酶的混合液是由浓度为1mg/mL的胶原酶A和浓度为1mg/mL的中性蛋白酶混合得到的，所述胶原酶A与所述中性蛋白酶的体积比为1：2‑1：4；(3)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；(4)加入胰酶，置于CO₂培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清液；所述胰酶的浓度为0.05％‑0.25％，添加量为每10‑15cm脐带添加15mL，消化时间为10‑15分钟；所述胰酶中添加有0.02wt％的EDTA，以所述胰酶的总量计；(5)用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO₂培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液；其中，所述MSCs培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以所述用于培养间充质干细胞的无血清培养基的体积计，其包括以下成分：α‑MEM 10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L‑谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188 100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes 5mM、β‑巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸0.28mg/L、亚油酸0.28mg/L、亚麻酸0.28mg/L、Cu 5nM、Se 30nM、Zn 1mM、Ga 0.3mM、Cr 5μM、Mg 0.3mM、Mn 5nM、谷胱甘肽1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP 50mg/L、维生素C 20mg/L、式I所示的化合物10μM、式II所示的化合物20μM、黄体酮15ng/mL、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、EGF 10ng/mL、b‑FGF 10ng/mL、HGF 10ng/mL、VEGF 10ng/mL；