一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法及应用

摘要

一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法及应用，它涉及一种红皮云杉植株再生方法及其应用。本发明要解决现有方法对红皮云杉繁殖率低，繁殖周期长，以及对其黄酮类化合物提取率低的问题。本发明通过对红皮云杉体细胞诱导前进行干化处理，提高体细胞胚的萌发率，并通过改进培养基以及培养条件，缩短了繁殖周期，采用低成本的原料以适用于工业化生产；本发明通过改变温度、光照以及诱导剂来提高PAI的活性，从而提高红皮云杉的黄酮类化合物的合成量，进而为后续提高其提取率奠定基础；本发明通过匀浆法结合微波方式提取红皮云杉中的黄酮类化合物，提高其提取率，减少杂质的产生。

主权项

一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、在六月中旬至七月中旬，采摘无性系球果，消毒后，取种球未成熟合子胚，作为体细胞胚诱导外植体材料；二、对步骤一的外植体材料进行干化处理：1)将外植体材料置于放有多层滤纸的培养皿内，用封口膜将培养皿封口，然后将培养皿置于培养容器内，再向培养容器内倒入无菌水进行培养；2)培养条件：在10～60μmol·m^‑2·s^‑1的光照、光照时间为12h、温度为22～25℃条件下培养1～3周，取胚轴及红色胚根作为下步处理的外植体材料；三、将步骤二干化处理后的外植体材料在无菌条件下，接入到诱导培养基上，在温度为22～26℃、黑暗条件下诱导培养出胚性愈伤组织；所述的诱导培养基中6‑BA的浓度为0～2.0mg/L、萘乙酸浓度为1.0～5.0mg/L、水解酪蛋白浓度为0.7～1.0g/L、谷氨酰胺浓度为450～500mg/L、蔗糖浓度为20～25g/L、凝胶浓度为2～4g/L、激动素浓度为0.5～2.0mg/L和活性炭1～3g/L；pH控制在5.6～5.8；四、体细胞胚的培养：1)将上一步骤获得的胚性愈伤组织，切取胚性愈伤组织按质量体积比为1g：10～20mL的比例将其加入到液体培养基中混合，然后过滤，过滤掉液体培养基，将剩余的胚性愈伤组织置于诱导培养基上，在温度为20～25℃、13～15h的光周期、光照强度为1200～1800LX的条件下进行培养20～30d，得愈伤组织；诱导培养基为3/4MS培养基；其中，6‑BA浓度为0.1～2.0mg/L、玉米素ZT浓度为0.3～1.5mg/L、蔗糖浓度为20～25g/L、水解酪蛋白浓度为0.7～1.0g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为2～4g/L；2)将在上步诱导培养基上培养的愈伤组织转移至诱导出芽培养基上，在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下，培养15d；诱导出芽培养基为1/2MS培养基；其中，赤霉素浓度为0.1～1.0mg/L、萘乙酸浓度为0.01～0.1mg/L、谷氨酰胺浓度为500mg/L、蔗糖浓度为30～40g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为7～8g/L；3)将上步培养后长出的不定芽在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培养4～5d，然后喷洒280～320mg/L的乙烯利，并用蓝光照射3～5h，继续在在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培1d，然后转移至生根培养基上，在光照时间为15～20h、温度为22～25℃条件下培养20～30d；所述在生根培养基上培养的光照条件为：在第1～10d光照为5～10μM·m^‑2·s^‑1，在第11～18d光照为15～20μM·m^‑2·s^‑1，在第19～30d光照为25～40μM·m^‑2·s^‑1；生根培养基为1/2MS培养基；其中，吲哚乙酸浓度为0.1～5.0mg/L、蔗糖浓度为10～30g/L以及凝胶浓度为2～8g/L；五、炼苗：在不定根生长至1.0～1.5cm，打开试管瓶口，在自然光照下，炼苗3～5d，取出后，栽入到腐殖土+珍珠岩+蛭石+禽畜粪便按质量比6∶4∶3∶1的比例混合的基质上，即完成所述的红皮云杉体细胞胚诱导植株再生。