单个靶实体的免疫化学检测

摘要

本发明涉及免疫化学地可视化和定量样品中的单个靶实体，如单个分子、单个分子结构、单个粒子等，其中所述单个实体被固定。具体而言，本发明涉及了用于可视化和定量生物靶或化学靶的单个单元的方法，尤其涉及免疫化学可视化组织学样品中的生物靶的单个分子。本发明的方法包括由具有氧化还原酶活性的酶所介导在样品的单个靶位点处形成可检测分子的离散沉积物的步骤，其中单个靶位点包含单个靶单位。本发明还涉及包括本发明可视化和定量方法的测定法。该方法应用报道分子沉积技术(CARD)和至少两种不同的底物，其中一种是水溶性偶联物，其包含能够作为酶的底物的两种化合物和可检测标记物。

主权项

一种用于使样品中单个靶单位可视化的方法，其中所述靶被固定，包括a)将含有单个靶单位的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与单个靶单位直接结合，并且，用单个靶单位的部分亚群体形成一个或更多个离散的单个靶位点，其中每一单个的离散单个靶位点含有所述部分亚群体的一个单个靶单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；b)将a)的样品在水溶液(i)中孵育，所述水溶液(i)含有范围为0.1mM至小于5mM的量的过氧化物化合物，与a)的离散单个靶位点结合的所述酶的第一底物，以及，所述酶的第二底物，其中所述第一底物是水溶性富电子化合物，其(3)能够与所述酶反应时产生自由基；并且(4)能够在所述酶和过氧化物化合物存在时交联所述第二底物分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，其中具有氧化还原酶活性的酶的所述第一底物是含有式(I)结构的化合物式(I)：其中，R₁是芳基或乙烯基，R₂、R₃和R₄独立地是‑H、‑N‑(X)₂、‑O‑(X)₂，其中X是烷基、乙烯基或芳基，或‑H，并且其中R₂、R₃和R₄不同时为‑H，其中，H是氢；O是氧，其中，所述第二底物是偶联物分子，其含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自发光性、放射性或生色性物质以及特异性结合对的成员，从而在a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且使所述a)的单个靶位点可视化，其中所述偶联物分子含有至少一种由式(II)定义的化合物作为具有氧化还原酶活性的酶的底物：式(II)：其中，R₁是–H、–O‑X、‑N(X)₂或‑S‑X，R₂是–H、‑O‑X、‑N(X)₂或‑S‑X，R₃是–H、‑OH、‑NH₂或‑SH，R₄是‑H、‑O‑X、‑N(X)₂或‑S‑X，R₅是–H、‑O‑X、‑N(X)₂或‑S‑X，R₆是‑CON(X)₂或‑CO‑X，其中，H是氢，O是氧，S是硫，N是氮，并且X是‑H、烷基或芳基。