一种单管高通量测序文库的构建方法

摘要

本发明公开了一种单管高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：(1)针对若干目的基因分别设计若干对基本扩增引物；(2)设计一对不对称连接探针和一不与人类基因组形成互补的通用引物；(3)将模板、上述若干对基本扩增引物、不对称探针、通用引物置于一含有DNA连接酶和DNA末端修饰酶的PCR反应体系中进行扩增，得扩增产物，该扩增的程序依次包括：预变性、第一阶段扩增和第二阶段扩增；(4)将扩增产物纯化后，即得所述高通量测序文库。本发明的单管高通量测序文库的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上肿瘤、遗传病等疾病中在少量的临床样本基础上需要对体细胞多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

主权项

一种单管高通量测序文库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)针对若干目的基因分别设计若干对基本扩增引物，在基本扩增引物的正向引物和反向引物的5’端均连接2～5个T，并在该2～5个T的靠近3’端的第一个T上进行PNA修饰，该若干对基本扩增引物的Tm值相差不超过1℃，相应的退火温度为56～64℃；(2)设计一对不对称连接探针和一条不与人类基因组形成互补的通用引物，该对不对称连接探针包括可自身形成环状的一条正向探针和一条反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一段能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一段与所述通用引物互补配对的扩增序列和一段与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，上述正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，且上述正向探针和反向探针自身形成环状的退火温度与基本扩增引物的退火温度相差不超过1℃；(3)将模板、上述若干对基本扩增引物、不对称探针、通用引物置于一含有DNA连接酶和DNA末端修饰酶的PCR反应体系中进行扩增，得扩增产物，该扩增的程序的时间为2～3h，并依次包括：预变性、第一阶段扩增和第二阶段扩增，其中第一阶段扩增依次包括第一变性阶段、第一退火阶段和第一延伸循环阶段，第一延伸循环阶段的循环数为5～15，第一退火阶段的退火温度为60～65℃，第二阶段扩增依次包括第二变性阶段、第二退火阶段和第二延伸循环阶段，第二延伸循环阶段的循环数为15～30；第一退火阶段的退火温度比第二退火阶段的退火温度高4～8℃；(4)将扩增产物纯化后，即得所述高通量测序文库。