一种荷叶离褶伞原生质体制备及再生方法

摘要

本发明涉及一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法。该制备方法如下：将菌龄72‑96h的荷叶离褶伞菌丝用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂处理后、用含有质量浓度1%溶壁酶与0.5%蜗牛酶的混合酶液于30℃酶解2.5‑3h，然后自制针管过滤器分离，得到荷叶离褶伞原生质体，原生质体得率为4.79×10⁷个/mL即5.76×10⁵个/mg，原生质体再生率为7.81%。本发明溶壁酶和蜗牛酶的混和酶，较单一溶壁酶作用，提高了原生质体制备及再生率，而且降低了成本；本发明采用小针管小面积过滤的方法，较常规方法降低了成本，为利用原生质体技术进行荷叶离褶伞育种奠定基础。

主权项

一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法，其特征是：（1）供试菌种荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）”，菌种保藏号CGMCC No：1518，荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes）食用菌菌种，菌株号ZY48‑1”；（2）溶壁酶和蜗牛酶混合酶液配置用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为1.6‑2.4%、蜗牛酶质量浓度为0.8‑1.2%，将1.6‑2.4%溶壁酶和0.8‑1.2%蜗牛酶按质量份数1：1混合，使混和酶中溶壁酶浓度为0.8%‑1.2%，蜗牛酶浓度为0.4%‑0.6%，置于8000‑10000r/min离心10‑15min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用；（3）荷叶离褶伞液体菌种培养将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25℃恒温培养箱内，连续培养5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0.5cm的无菌打孔器取活化后的菌落三块，接种于80mL‑100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶250mL中， 在22‑25℃、120‑150r/min及黑暗条件下连续培养72h‑96h，得到活化液体菌种，取上述4mL ‑5mL活化的菌液加入到盛有80‑100mL马铃薯葡萄糖液体培养基的250mL三角瓶中，22‑25℃、120‑150r/min及黑暗条件下培养72h‑96h；（4）荷叶离褶伞原生质体的制备取2层擦镜纸衬于直径10cm漏斗，置于121℃高压灭菌30min，将步骤（3）三角瓶所得荷叶离褶伞液体菌种倒入上述灭菌漏斗中过滤，用无菌水冲洗5遍，用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2遍收集菌丝体，取30mg～80mg菌丝， 加入（2）步骤所得0.12mL～0.32mL的溶壁酶和蜗牛酶混合酶液，置于30℃黑暗酶解2.5‑3h，每30min‑40min震荡一次，得到原生质体酶解液；准备1mL规格的玻璃针管，在针管中预置脱脂棉，用针管的推进器压紧，最终脱脂棉高度0.5‑0.8cm，置于121℃高压灭菌30min，得自制针管过滤器，用1mL移液枪将得到的原生质体酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将0.8‑1mL0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂加入自制针管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于3500r‑4000r /min离心10‑15min，弃上清液，收集沉淀，即得荷叶离褶伞原生质体，用0.5mL0.6mol/L的蔗糖渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2‑3次，再用0.24mL～0.64mL的0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液；（5）原生质体再生在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将（4）步骤所得荷叶离褶伞原生质体稀释至10⁴个/mL，取该悬液80‑100µL，涂布原生质体再生培养基上，原生质体再生培养基为：马铃薯200g，麸皮30g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨3g，蔗糖20g，0.6moL/L蔗糖渗稳剂，琼脂20g，水1000mL，pH值自然； 25℃恒温黑暗培养10‑15天统计原生质体再生率。