主权项 |
一种弓形虫串联多表位基因ELISA检测试剂盒,包括96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、兔抗羊IgG‑HRP结合物、串联MIC1、MAG1、SAG1基因表达纯化蛋白、终止液、底物A、底物B、阳性样品、阴性样品、盖板膜;其特征在于:1)96孔ELISA板是将串联MIC1、MAG1、SAG1基因纯化蛋白稀释到10ug/mL,每孔100ul包被ELISA板,37℃孵育1h,洗涤后加入5%的BSA封闭液,37℃封闭1h,洗涤后真空封装;2)样品稀释液是将NaCl 8.0g;KH2PO4 0.2g;Na2HPO4 ·12H2O 2.9g;KCl 0.2g补加二馏水致1000ml;加入0.5ml Tween‑20,最后50ml分装;3)20倍浓缩洗涤液是将NaCl 160.0g;KH2PO4 4g;Na2HPO4 ·12H2O 58g;KCl 4g补加二馏水致1000ml;加入10ml Tween‑20,最后50ml分装;4)兔抗羊IgG‑HRP结合物是将10ml PBST加入5ul兔抗羊IgG‑HRP二抗,然后加入4%PEG,25ml分装;串联MIC1、MAG1、SAG1基因表达纯化蛋白是根据GenBank中弓形虫MIC1、MAG1、SAG1序列,设计特异性引物,根据GenBank中弓形虫MIC1、MAG1、SAG1序列,设计特异性引物如下:MIC1‑F:GGATCCGCGTCGCATTCTCATTCG BamH I, 24bp, 18, GC% 58.3, Tm 74.2‑R:GAATTCGGCCTTCTCGTAACACCTCC EcoR I,,26bp, GC%53.8, Tm 69.5MAG1‑F:GAATTCAGCCAAAGGGTGCCAGAG EcoR I ,24bp, GC%54.2, Tm 69.0‑R:AAGCTTAGATCCCTGAACCCTTAGAATATACAC Hind III, 33bp, GC% 39.4, Tm 65.5SAG1‑F:AAGCTTGATCCCCCTCTTGTTGCC Hind III, 24bp, GC%54.2, Tm69.4‑R:CTCGAGAAGAGTGCTGTCTGCACCGT Xho I , 26bp, GC%57.7,Tm 71.1通过RT‑PCR技术扩增分别扩增弓形虫MIC1、MAG1、SAG1基因,通过RT‑PCR技术扩增弓形虫MIC1、MAG1、SAG1基因,将目的片段克隆到T载体,经酶切鉴定和测序分析,结果证明获得MIC1、MAG1、SAG1基因;将多表位基因与原核表达载体pET‑28a相连接,转化至大肠杆菌中,以IPTG诱导,经SDS‑PAGE和Western blotting分析MIC1、MAG1、SAG1蛋白;应用Ni‑NTA对表达蛋白进行纯化,获得理想浓度的纯化蛋白;终止液是将2mol/L H2SO4 浓硫酸44.5ml,双蒸水355.5ml,10ml分装;5)底物A:TMB 200mg,无水乙醇100ml,加双蒸水至1000ml,10ml分装;7)底物B:(0.1ml/L柠檬酸‑0.2ml/L磷酸氢二纳,pH5.0‑5.4):Na2HPO4 14.60g,柠檬酸9.33g,0.75%过氧化氢尿素6.4ml,加三蒸水至1000ml,调至pH5.0‑5.43,10ml分装;8)阳性样品:将标准弓形虫阳性血清1:5稀释于样品稀释液中,1ml分装;9)阴性样品:将经检测弓形虫阴性血清1:5稀释于样品稀释液中,1ml分装。 |