以TiO₂纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法

摘要

本发明涉及一种以TiO₂纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，其分别通过水热法、化学氧化聚合法以及柠檬酸三钠还原法最终合成出GNPs‑PANI‑TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。以BS³为双氨基交联剂将蛋白G′共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体(Ab1)。BS³还被用于结合辣根过氧化物酶（HRP）和信号抗体（Ab2）以制备示踪标记物。采用本发明方法制备所得的电化学免疫传感器能够快速的测定α‑甲胎蛋白AFP，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。

主权项

一种以TiO₂纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：① GNPs‑PANI‑TNT复合材料的制备：TiO₂纳米管的制备：将0.6 g TiO₂ 纳米颗粒和120 mL、10 M的 NaOH水溶液混合后，转移至反应釜中，120±5℃下水热反应48 h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涤后，在60℃条件下干燥2 h，备用，记为TNTs；聚苯胺‑TiO₂纳米管复合材料的合成：将0.2660 g TNTs、8.57 mL 0.1 M苯胺盐酸液、以及10 mL 0.1 M的盐酸混合，0－5℃冰浴下磁力搅拌 30 min以获得均匀的分散液；然后在2 h内加入8.57 mL、0.1 M的过硫酸铵盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3 h，室温静置过夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涤至pH 为7，60℃下干燥3 h后研磨成粉末，备用，记为PANI‑TNT；金纳米颗粒‑聚苯胺‑TiO₂纳米管复合材料的制备：取18 mg PANI‑TNT和18 mL 超纯水，混匀，在搅拌条件下加入1 mL、0.01 M 的HAuCl₄溶液和 1 mL、0.01 M 的封端剂柠檬酸三钠溶液，然后在20 min内加入1 mL 新制的0.1 M的 NaBH₄ 溶液，室温下继续搅拌0.5 h后静置过夜，离心分离，沉淀物洗涤后，60℃下干燥过夜，备用，记为GNPs‑PANI‑TNT；②标记信号抗体Ab2的制备：氨基化TiO₂纳米管的制备：将100 mg TNTs与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷混合后，机械搅拌过夜以防止TNTs沉淀，离心分离，弃去上清液，所得固体残留物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH₂‑TNT；辣根过氧化物酶︱氨基化TiO₂纳米管︱信号抗体生物共轭体的制备：将2 mg BS³溶解在0.5 mL、0.02 M 的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3 mg NH₂‑TNT分散于溶液A中，搅拌下加入350 μL 2 mg·mL^‑1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30 min，然后加入20 μL 含0.6 mg·mL^‑1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4℃下搅拌4 h，离心分离，所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤并用含2% 牛血清蛋白的PBS缓冲液在室温下封闭30 min，最后用PBS缓冲液洗涤后，分散于含0.1% 牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为HRP︱NH₂‑TNT︱Ab2；③免疫传感器的构建：首先，将5 mg 步骤①所得GNPs‑PANI‑TNT分散于1 mL 含0.2% 壳聚糖的HAc溶液中，超声20 min以得到均匀的分散液，取5 μL分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室温下自然晾干；然后在玻碳电极表面滴加10 μL 含2 mg·mL^‑1 BS³的PBS缓冲液并在室温下孵育1 h，随后滴加10 μL 1 mg·mL^‑1 的蛋白G′，室温下孵育60 min，浸入PBS缓冲液中洗涤3 min，然后将该玻碳电极用5 μL封闭缓冲液孵育30 min，再分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤3 min，最后将5 μL 0.44 mg·mL^‑1 的捕获抗体Ab1滴加在该玻碳电极表面，室温下孵育1 h，再在4℃、100%湿度饱和环境下孵育过夜后，分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤，即得电化学免疫传感器。