脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用。所述细胞网络模型包括原代同源的中枢神经系统毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元，按其在体内相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，利用低氧调控系统/普通细胞培养系统和无糖细胞培养液/正常细胞培养液，模拟体内脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤时中枢神经系统中的氧糖剥夺/复氧糖环境。本发明首次提出经插件内腔中枢神经系统毛细血管内皮细胞培养液给药的药物研究模式，更符合生物体药代动力学，用于脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤产生与发展机制的深入研究，为临床诊断标志物以及药物研究与评价提供新的细胞网络模型。

主权项

一种脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其特征在于，所述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型由包括以下步骤的方法构建，(1)中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型的构建(1‑1)分别培养原代同源的中枢神经系统中毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元；(1‑2)将原代培养后已成熟的中枢神经系统毛细血管内皮细胞种植到已包被胶原蛋白的插件底膜内侧面，插件内、外腔均为中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液，待中枢神经系统毛细血管内皮细胞长满插件底面并且形成紧密连接时，将原代培养后已经纯化的星形胶质细胞进行胰酶消化，同时取出长满中枢神经系统毛细血管内皮细胞的插件倒置放于无菌培养皿中，将星形胶质细胞悬液植于插件底膜外侧面；之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统孵育3小时；(1‑3)插件翻转插入装有中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液的培养孔，同时在插件内加入中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液，待中枢神经系统毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养至星形胶质细胞基本长满插件底膜外腔面，将中枢神经系统毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养的插件放置于已经成熟稳定的神经元培养孔中，即构建了基础细胞网络模型，(2)脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的构建(2‑1)将中枢神经系统毛细血管内皮细胞无糖培养液和神经元无糖培养液置于低氧调控系统中平衡过夜，以充分排除液体内溶解的O₂，实验时，取出基础细胞网路模型，在低氧调控系统内，以无糖无氧中枢神经系统毛细血管内皮细胞和神经元培养液分别完全置换插件内、外腔的中枢神经系统毛细血管内皮细胞和神经元完全培养液，再将细胞置于37℃，95％N₂和5％CO₂混合气培养舱中开始氧糖剥夺处理2小时，此时，整个细胞模型处于急性缺氧缺糖环境中，以模拟脑与脊髓急性缺血时中枢神经系统的状态；(2‑2)急性氧糖剥夺处理完成后，将插件内、外腔无糖细胞培养液分别更换为正常的中枢神经系统毛细血管内皮细和神经元完全培养液，同时将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养30分钟、3小时或3天，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注。