发明名称 |
一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法 |
摘要 |
本发明涉及检测<i>LEPR</i>基因245bp deletion可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法,解决程序繁琐、耗时长、准确率低的问题,以待测cDNA为模板,引物对ACTB为引物,实时荧光定量PCR扩增<i>ACTB</i>内参基因,以引物对P为引物,实时荧光定量PCR扩增,荧光定量PCR扩增的反应体系由2×SYBR<sup>®</sup>Premix Ex Taq<sup>TM</sup><img file="dest_path_image001.GIF" wi="13" he="19" />、去RNA酶的超纯水、引物P‑F或ACTB‑F、引物P‑R或ACTB‑R、cDNA模板构成,反应方法是预变性、变性、退火、延伸;对qPCR实时监测结果进行分析,用2<sup>‑△CT</sup>相对定量的方法计算,用SPSS version 20.0进行差异显著性检验,本发明准确、快速、方便,适用性强。 |
申请公布号 |
CN104673912B |
申请公布日期 |
2017.03.29 |
申请号 |
CN201510077497.1 |
申请日期 |
2015.02.13 |
申请人 |
河南农业大学 |
发明人 |
刘小军;王丹丹;徐春林;李转见;王台安;蒋瑞瑞;闫峰宾;康相涛 |
分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I |
主分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I |
代理机构 |
郑州天阳专利事务所(普通合伙) 41113 |
代理人 |
聂孟民 |
主权项 |
一种检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)以待测cDNA为模板,以引物对ACTB为引物,实时荧光定量PCR扩增ACTB内参基因,以引物对P为引物,实时荧光定量PCR扩增鹌鹑的LEPR基因245bp deletion可变剪接体,所述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2×SYBR<sup>®</sup>Premix Ex Taq<sup>TM</sup> Ⅱ9~11μL,去RNA酶的超纯水7~8μL,引物P‑F或ACTB‑F0.5~1μL,引物P‑R或ACTB‑R0.5~1μL,cDNA模板0.5~1.5μL,其反应方法是92~96℃预变性4~6min,92~96℃变性8~12s,55~65℃退火25~35 s,70~74℃延伸25~35s,35~45个循环;检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物,是针对鹌鹑LEPR基因mRNA水平245bp缺失后的部分第9外显子和第11外显子连接处的序列‑TGTGAACGATCGCGAGCAA‑设计识别该可变剪接体的特异性引物P‑R;在第9外显子上设计该可变剪接体的上游引物P‑F,引物对P只能扩增有245bp缺失的剪接体,从而避开其他已知或未知LEPR基因可变剪接体的干扰;所述的引物对P为:上游引物,P‑F:5’‑ TCCCTACCAAGATGCTGAC ‑3’;下游引物,P‑R:5’‑ TTGCTCGCGATCGTTCACA ‑3’;所述的引物对ACTB为:上游引物,ACTB‑F:5’‑ GAGAGAAGATGACACAGAC ‑3’;下游引物,ACTB‑R:5’‑ GTCCATCACAATACCAGTGG ‑3’;(2)对步骤(1)的荧光定量PCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析,采用 2<sup>‑△CT</sup>相对定量的方法计算,用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。 |
地址 |
450002 河南省郑州市文化路95号 |