一种快速灵敏检测小分子RNA的方法

摘要

本发明公开了一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，属于分子生物领域，包括以下步骤：（1）提取、纯化待检测小分子RNA；（2）探针设计：探针用生物素或地高辛进行标记；（3）液相杂交：将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，用外切酶切除未杂交的多余单链后进行凝胶电泳；（4）转膜：将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物（如尼龙膜，纤维素膜）上；（5）抗体孵育：将步骤（4）所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交；（6）信号检测。本方法最低可以检测0.005fmol的miRNA，灵敏度比现有技术提高了至少10倍。本方法检测速度快，可实现高通量检测和定量检测。

主权项

一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取、纯化待检测小分子RNA；（2）探针设计：根据待检测小分子RNA的碱基序列设计探针，探针设计时，先设计成DNA形式，根据此设计反向互补的寡核苷酸，并在5’端随机增加2个核苷酸后，再用生物素或地高辛标记探针；（3）液相杂交：将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，杂交缓冲液中，磷酸根浓度为 0‑0.5 M，Na⁺浓度为 0‑1.5 M，EDTA浓度为0‑0.5 M，pH为6.0‑9.5；杂交反应体系于95 ℃变性5 min，然后在 42 ℃杂交1 h；并消化掉未杂交的单链序列，然后进行凝胶电泳；（4）转膜：将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物上；（5）抗体孵育：将步骤（4）所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交，具体操作为：先将含有杂交产物的固相支持物加入封闭液后在37 ℃下孵育5 min，弃封闭液，然后加入稀释的抗体，在37 ℃下孵育30 min；（6）信号检测：检测步骤（5）所得的固相支持物上的信号。