胶原抗冻肽的分离方法

摘要

一种胶原抗冻肽的分离方法，主要包括胶原蛋白的制备、胶原酶解复合物的制备和胶原抗冻肽的分离三个步骤，最终得到具有较高抗冻活性的胶原抗冻肽，其氨基酸全序列为Leu-Gly-Lue-Gly-Pro-Leu-Gly-Arg-Gly-Pro-Leu-Leu。该分离方法分离过程简单，成本低，易于实现规模化生产。

主权项

一种胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：A、胶原蛋白的制备A1、取畜禽皮去除表面的毛，以蒸馏水洗净，于‑20℃保存备用；A2、将经过A1处理的畜禽皮剪碎，以10％丁醇溶液脱脂，再用蒸馏水洗净；A3、以0.5M醋酸溶液浸泡脱脂后的畜禽皮，并以10倍体积的相同溶液匀浆；在匀浆液中加入1％的胃蛋白酶，在4℃下水解，水解完毕后离心，收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末进行盐析，静置沉淀后离心；收集沉淀溶于0.5M醋酸溶液并置于透析袋内，依次用0.02M的Na₂HPO₄、0.1M醋酸及蒸馏水作为透析外液进行透析；然后将透析袋内的溶液冻干，得到含胶原蛋白的冻干液，于‑20℃保存备用；B、胶原酶解复合物的制备B1、采用碱性蛋白酶对步骤A3所得含胶原蛋白的冻干液进行可控酶解，酶解条件为：温度55℃、酶添加量5％、pH 7.8、胶原蛋白浓度20.75mg/mL、水解度9％；B2、酶解反应终止时，将酶解产物置于沸水浴中灭酶，冷却后离心分离，取上清液冷冻干燥后得到胶原酶解复合物；C、胶原抗冻肽的分离C1、搭建一个冰亲和吸附装置，该冰亲和吸附装置包括可控温的空心不锈钢棒、酶反应器、磁力搅拌器及可控温的低温反应槽，酶反应器放置在低温反应槽内；C2、先将不锈钢棒置于‑4℃的蒸馏水中，使其表面结上冰晶，再将表面结有冰晶的不锈钢棒放入酶反应器中，通过低温反应槽使其进一步降温至‑5℃；将步骤B2制备的胶原酶解复合物溶于双蒸水，并置于酶反应器中，使酶反应器的温度保持在0℃左右；开启磁力搅拌器，使不锈钢棒上附着的冰晶缓慢吸附胶原酶解复合物中的胶原抗冻肽；C3、吸附完毕后，将酶反应器中的液体倒出，并将其温度升高至2℃，使不锈钢棒上吸附的冰晶和胶原抗冻肽充分溶解，将溶解后的产物冻干，即获得胶原抗冻肽。