一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法

摘要

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法。利用免疫荧光、免疫印迹和流式细胞仪分析，确定了在Y精子中表达和定位于Y精子顶体部分的基因蛋白TSPY。本发明的蛋白TSPY可在哺乳动物X和Y精子的分离中作为Y精子标识抗原蛋白应用。该Y精子标识蛋白TSPY可在哺乳动物精液中X和Y精子分离中作为Y精子标识抗原蛋白，所述的哺乳动物包括牛、羊、猪、兔、马等，但不包括人类。本发明的Y精子标识蛋白用于分离X和Y精子具有准确、快速、简便、成本低、设备简单、对精子伤害小等优势，适于动物生产中应用。

主权项

一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物Y精子分型的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)利用免疫荧光方法检测TSPY蛋白在牛精子顶体部分中表达取适量荷斯坦奶牛精液加入磷酸盐缓冲液(PBS)，使精子浓度达到10⁵个/ml，再取100ul荷斯坦奶牛精液涂于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，通风晾置数分钟；用浓度为0.5％TritonX100/PBS缓冲液通透5min；再用浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)/PBS缓冲液封闭30min；在样品表面均匀涂抹上浓度为1％的体积比为1:100稀释的BSA/PBS稀释的TSPY蛋白抗体，4℃孵育过夜，用浓度为1％的BSA/PBS洗5min/3次；用体积比为1:200的1％BSA/PBS稀释液的荧光二抗羊抗兔Cy3稀释液，37℃孵育1小时，用PBS洗5min/3次；加入DAPI染核10min；加抗荧光淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察；检测TSPY蛋白在荷斯坦奶牛精子中的表达和定位；(2)利用Western Blotting检测TSPY蛋白在牛Y精子中的表达1)分别提取荷斯坦奶牛商业性控X精液和Y精液的蛋白，进行Western Blot分析，实验验证TSPY蛋白在奶牛X和Y精子中的差异化表达，并利用Image J软件进行相关的统计学分析；2)提取商业化的荷斯坦奶牛X精液和Y精液中的总蛋白，利用Western Blotting检测TSPY蛋白抗体与TSPY蛋白结合情况，用Image J扫描Western Blot结果灰度值，检测X精子中存在少量的TSPY蛋白表达，得到包含TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白；3)以TSPY蛋白为Y精子标识蛋白，利用TSPY蛋白抗体分离X精子和Y精子，用流式细胞仪分析分离出的X精子和Y精子的纯度；4)将荷斯坦奶牛精子与TSPY抗体以体积比为1：100混合，在37℃孵育40min，再与体积比为1：200的FITC羊抗兔荧光二抗在37℃孵育40min，洗涤后利用流式细胞仪分选出TSPY阳性精子，该精子即为Y精子，和TSPY阴性精子，该精子即为X精子；5)利用流式细胞仪分别检测分离出的X精子和Y精子的纯度，将分离出的X精子和Y精子分别再放入流式细胞仪中，分析它们与TSPY蛋白抗体结合的阳性比率；其中上述步骤中所述的TSPY蛋白的Y精子的标识蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(3)利用基因SRY‑PCR检测分离出的X精子和Y精子的纯度1)分别提取分离Y精子和分离X精子以及来自商业化的同一头荷斯坦奶牛的X精液、Y精液和普通精液基因组DNA，用半定量SRY‑PCR检测Y精子比例，检测分离出的X精子和Y精子的纯度，分别扩增各样本的SRY基因序列，所述的SRY基因的登陆号为ID:280931，用Image J软件统计分析扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图的灰度值；2)合成所述的SRY基因的扩增引物对，该引物对的序列如下所示：上游引物：CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA，下游引物：GCCTTCCGACGAGGTCGATACT‑3；3)提取5个样本DNA进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳分析所有样品，以登陆号为ID:281181的GAPDH基因作为内参基因，合成如下所述的引物对，其引物对的序列如下所示：上游引物：CTCACATTCCTAAGTCCGCTTT，下游引物：GTCCCTGAGCTTTGTCCTGTC 3。