一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法

摘要

一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，属于实验模型评估领域。将含有MicroRNA‑451的食物喂食给MicroRNA‑451基因敲除型小鼠，继而在小鼠体内检测到该种MicroRNA。喂食之后，小鼠红细胞的抗氧化能力增强，说明食源性MicroRNA可以通过消化道进入小鼠体内，并发挥功能，因此mm‑451基因敲除型小鼠不能排除食源性MicroRNA‑451的干扰，可靠性不高。本发明提供一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，将被使用MicroRNA基因敲除动物开展相关实验的研究机构和企业广泛应用，具有极大的科学价值和经济效益。

主权项

一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，其特征在于，包括以下步骤:1）准备好相关实验试剂；2）野生型小鼠和miR‑144/451基因敲除的雄性小鼠各两只，通过繁殖得到大量的野生型小鼠和miR‑144/451基因敲除鼠；3）按照SPF级饲养标准饲养小鼠，湿度控制在40%‑70%，温度控制在20‑25℃，用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次；4）合笼方式为1只miR‑144/451基因敲除的雄鼠和1‑5只miR‑144/451基因敲除的雌鼠交配进行繁殖，发现雌鼠有怀孕表现立即分笼生育，并及时记录生育出的小鼠父母系来源；5）步骤4）中的小鼠DNA提取:取3周龄的小鼠尾部末端组织，长度为0.5cm，放入1.5ml EP管中，每管加l00μl裂解液，95℃，静置20分钟，冷却后加入l00μl中和液混匀，取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR进行小鼠基因型鉴定；6）小鼠DNA的PCR：下列反应物构成20μl的PCR反应体系：含鼠DNA的上清液2μl、引物1μl、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl；上述材料混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增：预变性，95℃，5分钟；变性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循环，72℃，5分钟；7）进行琼脂糖凝胶电泳：取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中，微波炉中加热至沸腾，将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混匀，缓缓倒入已置好梳子的胶板中，室温放置30min，待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子；将制备好的1.5%琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入1×TAE溶液至高出凝胶表面；取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中，电压100V电泳，时间为30min；8）凝胶成像：电泳结束后，取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照，小鼠电泳基因型片段为：miR‑144/451野生型小鼠为290bp、纯合子190bpheterozygous (‑/+)250bp和190bp；9）喂食：使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR‑144/451野生型小鼠小内眦静脉取血200微升，使用12#灌胃器将野生型小鼠的血液喂食给miR‑144/451基因敲除型小鼠；10）提取样本：在喂食3小时、6小时、12小时、24小时后，分别使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR‑144/451基因敲除型小鼠小内眦静脉取血200微升；11）提取样本中的RNA：每0.1mL步骤10）得到的全血加入裂解液Trizolreagent 1 ml，大力混匀，静置5到10分钟；加入200μl氯仿，剧烈摇晃15s，静置5分钟；4℃，12000g离心15min；将上清转入新的EP管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀后室温沉淀10min； 4℃，12000g离心20min；弃上清，加入1ml75%乙醇；4℃，12000g离心5min；弃上清，室温静置至干燥加入20μlDEPC水溶解；55℃水浴5min；12）反转录RNA:配置反应液体系：步骤11）中得到的总RNA 1 ng、RTase Mix 1μl、5xReaction Buffer 5μl，使用ddH₂O将反应体系补足至25μl；混匀后加温至37℃，而后保温60分钟，再加温至85℃，保温10分钟；13）全血DNA的PCR：下列反应物构成20μl的PCR反应体系：步骤12）得到的全血DNA 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl 、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl；混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增：预变性，95℃，5分钟；变性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循环，72℃，5分钟；14）使用U6作为内参，判断miR‑451的表达水平。