一种简便高效的基因编辑方法

摘要

本发明公开了一种简便高效的基因编辑方法。本发明方法利用复制过程中基因组高频自发断裂和chi位点促进同源重组的原理，设计合成或构建带有并行重复序列和双向筛选标记基因的同源重组核酸片段，该片段在引入基因组后通过分子内同源重组消除引入的外源标记基因。相对于需要进行两次转化的传统基因编辑方法，本发明方法仅需要一次转化，并且可有效地提高负筛选的效率，最高可达到50%。本发明的方法可以实现基因的删除、替换、插入等基因编辑操作。

主权项

一种基因编辑方法，包括以下步骤：a.提供靶细胞，所述靶细胞包含带有待修饰位点的靶核酸；b.用包含所述待修饰位点的上下游同源序列、目的基因、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段转化所述靶细胞，以使所述核酸片段和靶核酸发生同源重组，所述核酸片段整合到靶核酸上；c.进行正筛选以筛选出在靶核酸上整合了目的基因和双向筛选标记基因的重组子细胞；d.允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，以删除标记基因；e.进行负筛选以富集删除了双向筛选标记基因的重组子细胞；步骤b中核酸片段上的并行重复序列为靶核酸上待修饰位点上游或下游的原始序列，或者，步骤b中核酸片段上的并行重复序列与靶核酸上紧邻待修饰位点的上游或下游的序列同源，以实现无痕编辑；步骤b中核酸片段上双向筛选标记基因为既可以进行正筛选又可以进行负筛选的基因；其中与待修饰位点的上下游序列同源的序列位于该核酸片段的两端，用于与靶核酸同源重组；所述并行重复序列一个位于待修饰位点的上游或下游，一个在核酸片段上，在发生所述步骤b中的同源重组之后，靶核酸上含有两个并行重复序列，所述两个并行重复序列之间隔着标记基因，然后所述两个并行重复序列发生分子内同源重组，从而除去标记基因。