一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法

摘要

本发明公开了山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法，采用木瓜蛋白酶将山羊乳酪蛋白酶解，酶解物经过大孔非极性树脂分离及脱盐，再经过半制备凝胶色谱仪纯化，冷冻干燥，即加工成山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉，经申请人进行的抗菌功能试实验结果表明，制得的该山羊乳酪蛋白源抗菌肽的分子量均在3000以下，易于吸收利用，所得山羊乳酪蛋白源抗菌肽二级结构主要为无规则卷曲，为无毒性的绿色天然抗菌肽，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等具有优良的抗菌性能，在乳与乳制品、化妆品和其他食品保鲜方面具有极其广阔应用前景。

主权项

一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法，其特征在于，具体按下列步骤进行：1)酪蛋白的提取山羊乳酪蛋白的提取是将鲜山羊乳离心脱脂后，利用等电点沉淀法将山羊乳酪蛋白提取出来；2)酪蛋白酶解物的制备酪蛋白酶解液的制备是用木瓜蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后，灭酶，冷却，离心，上清液真空浓缩后得酶解浓缩物；3)抗菌肽脱盐及分离纯化将步骤2)获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩液，先通过大孔吸附树脂层析柱脱盐、再用乙醇梯度洗脱，收集抑菌作用较高的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化，冷冻干燥，即得山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉；所述的山羊乳酪蛋白的提取的方法是，取鲜山羊乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L的HCl溶液调节脱脂羊乳的pH值到4.3，水浴40℃静置30min沉淀山羊乳酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值为4.3的醋酸‑醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物即为山羊乳酪蛋白粗品；所述的山羊乳酪蛋白酶解物的制备方法是，称取适量的山羊乳酪蛋白粗品置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到30g/kg～120g/kg的羊乳酪蛋白溶液，调节pH值至5.0～7.0，95℃加热5min，冷却到50℃～70℃，准确加入3000U/g～7000U/g的木瓜蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持恒定，酶解0.5h～4.0h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液在45～50℃，0.09MPa下浓缩，得山羊乳酪蛋白酶解浓缩物；所述的抗菌肽脱盐及分离纯化方法是，对大孔吸附树脂进行预处理后，用无水乙醇将树脂洗至220nm处无吸收峰，再用去离子水洗去乙醇并湿法装层析柱；将获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩物，先后通过大孔吸附树脂层析柱、凝胶色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化；所述大孔吸附树脂采用LS‑106极性大孔吸附树脂，获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩液，以0.5～1BV/h的流速，通过LS‑106大孔吸附树脂层析柱，再用去离子水洗脱层析柱，当水洗脱液的电导率和纯水基本一致时，脱盐结束，然后用乙醇进行梯度洗脱；所述乙醇浓度为40％、60％和80％，流速为1.5～2BV/h，收集浓度为60％的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱纯化；所述凝胶色谱的色谱柱为SephadexG‑75，流动相为pH6.0的50mmol/L醋酸‑醋酸铵溶液，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第3个峰，浓缩后即为精制山羊乳酪蛋白源抗菌肽；精制山羊乳酪蛋白源抗菌肽用半制备型高效液相色谱仪进一步纯化2次，收集其中的两个主峰，分别称为F3‑1和F3‑2，分别冷冻干燥即得纯山羊乳酪蛋白抗菌肽粉；所述的山羊乳酪蛋白源抗菌肽的一级结构为：Arg‑Val‑Asp‑Thr‑Asn‑Pro‑Asp‑Pro‑Glu‑Gln‑Val‑Gly‑Gly‑Leu；和Pro‑Asn‑Val‑Tyr‑Pro‑Phe‑Pro‑Gly‑Pro‑Leu；分子量均在3000以下，二级结构的主要元件为无规则卷曲；所述的山羊乳酪蛋白源抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有抗菌性能。