一种以悬浮细胞原生质体为受体的杂交鹅掌楸高效的瞬间基因表达方法

摘要

本发明公开了一种以悬浮细胞原生质体为受体的杂交鹅掌楸高效的瞬间基因表达方法，包括：杂交鹅掌楸悬浮系细胞原生质体的制备、质粒的准备、转化和观察。本发明以杂交鹅掌楸悬浮系细胞的原生质体做为遗传转化的受体系统，通过PEI介导的方法，以绿色荧光蛋白GFP基因作为报告基因，通过荧光显微镜检测到GFP基因高效的瞬间表达。本发明采用杂交鹅掌楸悬浮系细胞作为原生质体的来源，材料丰富且状态一致，背景信号弱，取材方便，建立的瞬间表达体系可为鹅掌楸及木兰科植物基因功能的研究提供一个快速方便的操作平台。

主权项

一种以悬浮细胞原生质体为受体的杂交鹅掌楸高效的瞬间基因表达方法，其特征在于，包括以下步骤：1）使用QIAGEN Plasmid Midi Kits抽提纯化质粒，将其调整到1 μg/μl的浓度后，‑20℃保存备用；2）杂交鹅掌楸悬浮系细胞原生质体的分离纯化，获得浓度为10⁶/mL的原生质体；3）取3 μg质粒于2 mL离心管中，加入1μg PEI，并加入PBS至体系为50μL，通过超声波超声2分钟充分混匀，然后室温静置反应30分钟，制备PEI/DNA基因载体复合物；然后加入200uL杂交鹅掌楸悬浮系细胞原生质体，用手指轻轻敲打使溶液混匀，室温静置转化5～10 min，然后加入800 uL W5溶液轻轻上下颠倒混匀，终止转染反应，1100rpm 离心2min，用枪头吸出上清，收集转化的原生质体细胞1mL WI溶液轻轻悬浮原生质体，并转移到细胞培养板上4）将细胞培养板放在23℃黑暗静置培养18 h后，置于荧光显微镜下观察。