一种牛肺抑肽酶异性制备层析介质的合成和应用

摘要

本发明涉及一种牛肺抑肽酶特异性制备层析介质，由人工配体和层析介质连接而成。其配体为2,4,6‑三甲基‑3,5‑二氨基苯磺酸，层析介质是sepharose与sephadex，亲和配体和层析介质通过间隔臂1,3‑二氨基‑2‑羟基丙烷与间隔臂三聚氯氰进行连接。建立了一种牛肺抑肽酶特异性制备层析介质的合成方法，以及利用上述的层析介质高效纯化牛肺抑肽酶的方法，利用该亲和介质可以大规模从原料中快速分离纯化分子量为~6 kDa的牛肺抑肽酶。整个过程只需要经过一步亲和层析，纯化得到的人尿胰蛋白酶抑制剂纯品，其收率大于85%，比活大于15000 IU/mg.pr。整个纯化步骤消耗时间短，活性回收率及比活较高，适于大规模推广应用。

主权项

一种牛肺抑肽酶特异性制备层析介质的制备方法，其特征是：（1）介质合成： 取sepharose 4B 2000g，用10倍体积的纯化水洗涤，抽干成湿饼状；加2000ml活化缓冲液，活化缓冲液由0.5MNaOH, 10%二甲亚砜，6%环氧氯丙烷组成，40℃搅拌2.5 h，然后倒入漏斗中，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状，活化的sepharose 4B介质加2000ml 含5% 1,3‑二氨基‑2‑羟基丙烷的水溶液, 60℃搅拌 20h，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状，加2000L 0.1M三聚氯氰的水‑丙酮溶液，使用0.1M氢氧化钠控制体系pH为7.5，4℃冰浴搅拌1h，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状，加2000 ml 0.15mol 2,4,6‑三甲基‑3,5‑二氨基苯磺酸水溶液，40℃搅拌12h，pH维持9‑10，用纯化水清洗，抽干成湿饼状即可；（2）纯化牛肺抑肽酶：取牛肺抑肽酶特异性制备层析介质2000ml，装柱，用10L 0.02M磷酸盐缓冲液pH7.0平衡，取115.2百万单位抑肽酶粗品，经溶解、过滤、浓缩至体积3.5L，过以上经过平衡的层析介质吸附，然后用10L 0.02M磷酸盐缓冲液pH6.8洗涤干净，再用0.05M GLY‑NaOH pH9.0甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱流出蛋白高峰段，即可。