提高转基因丹参中阳性率的方法

摘要

本发明涉及一种提高转基因丹参中阳性率的方法，应用根癌农杆菌介导的叶盘转化法操作简便、重复性高、能快速、有效获得转基因丹参植株。目前丹参植株遗传转化体系多采用卡那霉素进行筛选，但本实验室在对已经完成测序工作的99‑3品系的丹参进行遗传转化研究中发现99‑3丹参叶片对卡那霉素敏感，用它做筛选抗生素时叶片生长容易停止，实验重现性差。本方法采用50mg/L Hyg进行筛选时，不仅获得了阳性转基因植株，而且阳性率极高，接近100％。上述方法建立了一种以丹参叶片作为外植体，通过根癌农杆菌的遗传转化法将携带外源质粒转入丹参外植体中的高效可靠、简便的丹参植株提高阳性率的方法。

主权项

一种提高转基因丹参中阳性率的方法，其特征在于，所述方法包括：取丹参组培苗的叶片，将叶片去除叶片边缘后剪切成叶盘；将叶盘放置于不含潮霉素的第一固体培养基上，在25℃，光照16h/黑暗8h的条件下预培养两天；将带质粒的农杆菌接种于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.4‑0.8；取2mL农杆菌菌液离心，去除上清液，收集菌体后用MS重悬至30‑40mL用于侵染；将预培养过后的叶片放入含有农杆菌的MS培养基中侵染10‑15min，中间轻轻晃动以使菌液充分接触叶片；取出侵染后的叶盘，置于无菌滤纸上以吸干表面残余的菌液；将去除表面菌液的叶盘置于新的第一固体培养基上，在25℃，黑暗条件下共培养3天；2‑3天后将共培养过后的叶片转移至含有潮霉素的第二固体培养基上，光照培养，每隔10‑15天更换一次第二固体培养基以免抗生素失效；将成功分化出的小芽转移至含有潮霉素的第三固体培养基上继续培养，待叶片长得较大时再转移至含有潮霉素和吲哚丁酸的第四固体培养基上诱导生根和促进植株生长，其中，所述第二固体培养基、第三固体培养基和第四固体培养基中的潮霉素浓度相同。