一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法

摘要

本发明公开了一种有效观测油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，包括石蜡切片过程中样品的取样固定、保存整染、水洗返蓝、脱水透明加碎蜡、透蜡包埋、修蜡块、切片、展片、粘片、烘干、封片、烘片、观片等步骤。本发明采用石蜡切片技术可有效获得油棕雌蕊结构完整的石蜡切片，样品经石蜡包埋后，样品不受其褐变影响，能够长久保存，切片时间随意，获得的切片平整、无皱褶、厚度均匀，显微结果清晰，有利于开展油棕种质资源解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。

主权项

一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取样固定：首先摘取所要观察油棕整个的雌花序，立刻进行选择分割，选择需要观察的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剥下来，之后将萼片剥掉，立刻用刀将柱头与子房分开，立刻将柱头与子房一块放入盛有卡诺固定液的高型称量瓶里面；当所需的样品选取完后，用橡皮筋将扎有8～12个洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1～1.5个小时；其中：样品与卡诺固定液的质量体积比为1：16～1：20g/ml，卡诺固定液是按体积比3：1将乙醇与乙酸混合构成；(2)保存：样品经抽真空固定后，经浓度95％乙醇、85％乙醇，每级浸泡20～25min，之后转入浓度70％乙醇中浸泡2～3d保存备用，保存温度为16～18℃；(3)整染：将保存后的样品转入浓度50％乙醇‑乙二醇混合溶液中浸泡5～6h后，转入爱氏苏木精稀释液中，用橡皮筋将扎有8～12个洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1个小时后，继续放置在真空干燥器中，时间为20～24h，之后从真空干燥器中取出，盖上盖子，常温下继续放置48～52h；其中乙醇‑乙二醇混合溶液是按体积比4：1将乙醇与乙二醇混合构成；(4)水洗、返蓝：样品经爱氏苏木精稀释液染色后，用蒸馏水浸洗样品，之后用自来水返蓝，最后用蒸馏水浸泡；(5)脱水、透明、加碎蜡：蒸馏水浸泡5～7h后，经过脱水剂逐级脱水后，再经氯仿逐级透明后，先加入纯氯仿40～50％体积的碎蜡沫，在36℃温箱中保温1h，再加入以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中，在36℃温箱中保温24h以上；其中脱水剂为七种，依次为：浓度30％乙醇‑乙二醇混合水溶液、浓度50％乙醇‑乙二醇混合水溶液、浓度70％乙醇‑乙二醇混合水溶液、浓度85％乙醇‑乙二醇混合水溶液、含浓度1％伊红的95％乙醇、无水乙醇‑乙二醇混合溶液、无水乙醇；乙醇‑乙二醇混合水溶液中，乙醇与乙二醇的体积比均为4：1；无水乙醇‑乙二醇混合溶液中，无水乙醇与乙二醇的体积比为4：1；(6)透蜡、包埋：加碎蜡沫后的样品经浓度50％石蜡，浓度70％石蜡各浸泡3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯浸泡50min，包埋时样品横卧，样品与石蜡的体积比为1：60～1：80；(7)修蜡块、切片：将包埋样品后的蜡块分割，修整，修整好的蜡块固定在底板后，进一步修成梯形，其中梯形的下底与雌蕊的高平行，油棕雌蕊纵切，切片厚度为11～15μm；(8)展片、粘片、烘干：选取所需蜡带进行粘片，于温度为35℃的电热展片台展片后，将材料平放在铺有白色A4纸的托盘上，放置在温度为36℃鼓风干燥箱中，直至烘干；其中粘片时所选的高品质载玻片需用新医用脱脂棉擦干净，肉眼观察透亮无杂物，所选的蜡带长度小于封片时所用盖玻片长度；(9)脱蜡、透明：烘片结束后，在二甲苯溶液中脱蜡、透明各一次，每次浸泡28～35min；(10)封片、烘片：将从透明缸里面取出的载玻片放在圆形滤纸上面，从右边方向立即滴2～3滴封片剂，封片后放置在温度为36℃烘箱中烘烤10～15d，待树胶烤干后，进行观察；其中封片剂是按体积比5：1将中性树胶与二甲苯混合构成；(11)观片：将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。