快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法与应用

摘要

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法与应用。本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法包括外周血单个核细胞分离、浆细胞分离、抗体可变区基因的PCR扩增、抗体的克隆和共转染及鉴定等步骤。本发明提供的快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法简单快捷，不需要标记的抗原，可分离在体内存在而在体外很难效仿的构象结构域的功能性抗体，获得的特异性抗体对寨卡疫苗的研制有重要的指导意义，而且有些抗体可能具有临床治疗的应用前景。

主权项

一种快速制备寨卡病毒特异全人源单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1外周血单个核细胞分离：取寨卡感染者急性期外周静脉EDTA抗凝血，利用密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞，分装2‑4×10⁶/管，置于液氮中冻存；S2浆细胞分离：将步骤S1冻存的外周血单个核细胞放置于37℃水浴中溶化，用PBS缓冲液洗涤3‑4次，接着加入荧光标记抗体进行染色，室温避光孵育12‑16min，使用PBS缓冲液洗涤后，加入300‑500μlPBS缓冲液悬浮细胞上流式仪，分选出单个浆细胞于96孔PCR板中冻存；所述抗体为IgD、CD19、CD27、CD38、IgM和CD45，所述标记的荧光为FITC、ECD、PC7、APC A750、PB和KO；S3抗体可变区基因的PCR扩增和抗体的克隆：利用PCR方法从步骤S2得到的单个浆细胞中扩增抗体可变区基因，具体步骤如下：反转录合成cDNA第一条链：将含有单个B细胞的96孔板加入随机引物和反转录酶，涡旋混匀，反应加热后置于冰上，反转录得到cDNA；PCR扩增抗体基因：配制PCR体系，经过预变性、变性、退火、延伸循环，PCR扩增抗体可变区基因.PCR产物经凝胶电泳鉴定，对阳性的基因片段进行测序分析.将从同一样品孔中筛选得到的一对重链、轻链可变区基因分别连接到载体上构建抗体表达质粒；S4共转染及鉴定：将步骤S3构建的抗体表达质粒采用96孔板瞬时转染293T细胞，细胞培养2‑3天后收取培养上清用于ELISA鉴定。