一种结核分枝杆菌LAM检测试剂盒、制备方法以及使用方法

摘要

本发明涉及一种基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LMA)检测试剂盒。本试剂盒中，以近红外荧光染料标记靶向于LAM的单克隆抗体，靶向于LAM的多克隆抗体包被在纳米磁珠表面。采用双抗体夹心法原理，磁性分离结合物和游离物，采用便携式高灵敏度低噪声激发式荧光检测仪检测磁性结合物的荧光强度，从而检测待检样品中LAM含量。本发明适用于临床病理标本中的LAM检测，具有快速、灵敏、抗杂散荧光干扰、发射荧光保存时间长的特点。

主权项

一种基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为兔抗LAM；包被纳米磁珠的多克隆抗体为兔多抗LAM；建立LAM标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标多糖含量的定量检测；所述基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒的制备方法，步骤如下：(1)制备近红外荧光染料标记的LAM单克隆抗体；将购自Thermofisher公司的Dylight800用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释10倍，取1.4μL与购自Mossman Associates Inc公司的浓度为1mg/ml、20μg兔抗LAM单克隆抗体轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时；标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2000倍；(2)LAM多克隆抗体的制备1)LAM的提纯：将MTB H37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37℃培养3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，100℃水浴灭活2小时，用2ml的pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤2次，8000r/min、10min离心弃上清；加入2ml氯仿∶甲醇＝2∶1混合液脱脂3次，8000r/min，10min离心弃上清；加入2ml的pH值为7.4的PBS悬浮，冰浴超声破碎：超声10s，停10s，共30min，8000r/min，10min，离心取上清，加入2ml40％的苯酚萃取，70℃，1小时，8000r/min，10min离心取上清，用蒸馏水透析2天，采用SepHacryl S‑100凝胶柱层析，用0.05mmol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min，用EP管收集2ml/管；2)LAM的定量：取浓硫酸1ml，9％苯酚200μl，标本200μl，混匀后避光反应30分钟，空白调零，以L‑阿拉伯糖为多糖标准，制作浓度范围0.1～3.0mg/ml的标准曲线，测吸光度A₄₈₅值，直线回归计算标本中多糖含量；3)LAM多克隆抗体制备：以本实验室制备的LAM为免疫原，委托江南大学食品学院代为制备LAM多克隆抗体，制成后的抗体为兔抗LAM多克隆抗体，浓度为1mg/ml；(3)制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠，购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所；1)纳米磁珠的预处理：轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml的25mg/ml悬浮液加入1.5ml EP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；加入1ml 0.1M、pH为5.0的乙磺酸溶液，重悬磁珠；2)纳米磁珠的活化将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L，加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用，用该液重悬磁珠；用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；3)磁珠与蛋白的链接；在已处理好的磁珠中加入50μL的浓度为1mg/ml的LAM多克隆抗体和pH值为5.5的500μL PBS，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；用pH5.5，0.05％Tween的PBS缓冲液清洗3次，弃上清；加入1ml，0.1M，0.1％BSA Tris缓冲液，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；加入1ml，pH5.5，0.05％Tween的PBS缓冲液，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1ml的pH＝5.5的PBS缓冲液，弃上清，重复3次；弃上清时，试管需置于磁板上；加入1ml，pH＝7.4，0.05％Tween‑20，0.1％BSA，0.05％NaN₃的PBS缓冲液，待用；(4)制备LAM系列标准品；LAM，pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至1、5、25、125、625ng/ml。