一种试剂盒在利用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素中的应用

摘要

本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，包括洗脱液、标准品母液、混合内标液、稀释液、萃取液和质控品，所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α‑羟孕酮和17‑羟孕烯醇酮。采用本发明试剂盒进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10min之内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率基本满足要求。

主权项

一种试剂盒在利用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素中的应用；其中，所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α‑羟孕酮和17‑羟孕烯醇酮；所述试剂盒包括如下试剂：(1)洗脱液：洗脱液A：0.1％v/v甲酸水溶液；洗脱液B：0.1％v/v甲酸甲醇溶液；(2)标准品母液：含雄烯二酮、17α‑羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17‑羟孕烯醇酮的甲醇溶液；(3)混合内标液：含有d6‑脱氢表雄酮、d3‑睾酮、d8‑17α‑羟孕酮、d2‑雌酮和d9‑孕酮的甲基叔丁基醚溶液；(4)稀释液：稀释液1：空白血清基质溶液；所述的空白血清基质溶液为40mg/mL牛血清蛋白的水溶液；稀释液2：甲醇；(5)萃取液：甲基叔丁基醚；(6)质控品：含有雄烯二酮、17α‑羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17‑羟孕烯醇酮的空白血清基质溶液，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10种类固醇激素质控品对应浓度见表1；表1 10种类固醇激素质控品对应浓度，单位ng/mL具体检测方法如下：采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述10种类固醇激素，先利用高效液相色谱将10种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述10种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：(1)高效液相色谱条件：流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；色谱柱型号：Phenomenex C18 100mm×2.1mm，2.6μm；采用梯度洗脱的方式，见表2；流速为0.5mL/min，柱温为35℃，进样体积为20μL；表2流动相梯度洗脱参数(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为Medium；气帘气为40kPa；离子源雾化气和加热辅助气均为60kPa；去溶剂温度为550℃；同时监测了目标物孕酮m/z 345.093→124.1、孕烯醇酮m/z 332.0→86.2、17α‑羟孕酮m/z 361.0→112.2、17‑羟孕烯醇酮m/z 348.0→330.3、雄烯二酮m/z 317.0→112.2、脱氢表雄酮m/z 304.2→253.2、睾酮m/z 304.1/112.2、双氢睾酮m/z 306.2→81.1、皮质酮m/z 410.0→377.2和雌酮m/z 286.0→253.0以及同位素内标d2‑雌酮m/z 288.0→255.1、d6‑脱氢表雄酮m/z 310.3→219.2、d8‑17α‑羟孕酮m/z 269.2→115.1和d3‑睾酮m/z 307.0→112.2；各个目标物的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数见表3；表3 10种类固醇激素质谱参数