从RNA样本富集转录本的方法及其用途

摘要

本发明提出了从RNA样本富集转录本的方法及其用途。从RNA样本富集转录本的方法，包括：利用富集试剂对RNA样本进行处理，以便富集转录本，其中，所述富集试剂具有5’‑单磷酸外切酶活性，所述转录本为在其5’末端具有帽子结构或三磷酸基团的RNA分子。利用该方法能够有效地富集转录本。

主权项

一种确定转录起点的方法，其特征在于，包括：从宿主提取RNA样本，利用富集试剂对所述RNA样本进行处理，以便富集转录本，其中，所述富集试剂具有5’‑单磷酸外切酶活性，所述转录本为在其5’末端具有帽子结构或三磷酸基团的RNA分子；对处理后的RNA样本进行测序文库构建，包括，去除所述转录本的帽子结构或三磷酸基团，以便获得去除帽子结构或三磷酸基团的转录本，在去除帽子结构或三磷酸基团的转录本的5’末端连接RNA接头，以便获得连接有RNA接头的转录本，对连接有RNA接头的转录本进行反转录，以便获得与所述转录本对应的cDNA，所述反转录的反转录引物在其末端具有与所述RNA接头相对应的序列，所述反转录采用序列如SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸5’‑GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN‑3’作为反转录引物，所述反转录引物中至少一个N被硫代修饰，对所述cDNA进行扩增，以便获得扩增产物，基于所述扩增产物，构建测序文库；对所述测序文库进行测序，获得由多个测序序列构成的测序结果；基于所述测序结果，确定转录起点，包括，将所述测序结果与参考序列进行比对，所述参考序列中包含预定基因的5’‑UTR序列的至少一部分：针对原核宿主，所述参考序列包含所述预定基因的翻译起始位点与该翻译起始位点上游700bp位点之间的核酸序列，针对真核宿主，所述参考序列包含所述预定基因的翻译起始位点与该翻译起始位点上游5000bp位点之间的核酸序列，基于获得的比对结果，选择能够和所述参考序列对上、且在所述参考序列最上游的测序序列作为阳性序列，对所述阳性序列进行筛选，所述筛选的原则是：所述阳性序列的数目是比对到所述预定基因内部的测序序列数目平均值的N倍以上，其中所述N为至少10的实数，确定获得的筛选结果中的阳性序列的第一位碱基作为所述转录起始位点。