用于高通量酵母双杂交技术的重组载体及其大规模筛选互作蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种用于酵母双杂交的相关重组载体及其利用高通量测序技术大规模筛选互作蛋白的酵母双杂交的方法，该方法依赖于一种整合酶Integrase phiC31(En)的特有整合功能，通过对传统酵母双杂交载体的改造，使其与高通量测序技术有机结合，实现成百上千的Bait蛋白同时对Prey蛋白文库的筛选工作。将整合酶及其特异识别的核苷酸序列插入Matchmaker GAL4系统的载体中，通过酵母双杂交的方法使重组载体进入同一个酵母细胞，整合酶发生作用，将其特异识别的核苷酸序列及其紧邻的核苷酸序列进行特异性定向重排，从而使得两个重组载体融合成一个融合载体，此时猎物和诱饵蛋白序列被定向连接成融合载体上的一段新的序列，通过扩增、高通量测序，从而经济高效地筛选相互作用蛋白质并构建全面的蛋白互作网络图谱。

主权项

一种用于酵母双杂交的重组载体pGADT7‑ATTP‑phiC31，其特征在于：所述重组载体pGADT7‑ATTP‑phiC31是在载体pGADT7上插入solexa PE1‑MCS‑ATTP核苷酸序列和PolIII::phiC31‑Cyc1表达盒，所述solexa PE1‑MCS‑ATTP核苷酸序列替换Nde Ⅰ和Xho Ⅰ之间的序列及其Xho Ⅰ酶切位点，所述PolIII::phiC31‑Cyc1表达盒插入在NheⅠ上，其中，solexa PE1‑MCS‑ATTP核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，PolIII::phiC31‑Cyc1表达盒如SEQ ID NO：2所示。