肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法

摘要

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种具有增强仔猪和肉鸡的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，从猪血中分离白细胞，从分离的白细胞中通过利息破碎粗提抗菌肽，将抗菌肽用凝胶过滤层析纯化；将抗凝血离心得到血浆，通过盐析，纯化，得到免疫球蛋白；将抗菌肽和免疫球蛋白干粉混合制得微胶囊，再将微胶囊通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成肠溶微丸，本发明不仅能够显著提高动物血清中IgG含量，增强仔猪机体免疫力，降低发病率，提高动物的生产性能，而且解决了由于胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶降低药物药效和生物利用度的问题，从而使药物吸收效果更好。

主权项

一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）抗菌肽的制备：1.1从猪血中分离白细胞将混合均匀的干净血液放置到无菌容器中，然后在4℃、4000rpm/min的条件下下离心10min，此时无菌容器内的变成悬液，此时悬液分为上、中、下三层，收获中间层，并将中间层放置在另一个无菌容器中，在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，然后再在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，所剩沉淀即为白细胞；1.2抗菌肽的粗提将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分；将沉淀中加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于55℃—60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物；1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化取Superdex 30 pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用；步骤2）免疫球蛋白的制备：2.1分离血浆将抗凝血在4000 rpm/min的条件下离心15min，获得沉降的血细胞和上清液，其中上清液为血浆；2.2盐析取上清液，向上清液中加入PBS缓冲液使得混合后的溶液体积至1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20﹪，室温静置30min；然后在4℃ 4000 r/min的条件下离心15 min，弃沉淀收集上清液；2.3免疫球蛋白的分离向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，使溶液硫酸铵饱和度达到50%，静置30min，然后在4℃5000 rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品；2.4除盐用PBS缓冲液溶解免疫球蛋白粗品，装入透析袋，在4℃的条件下透析一天，得到脱盐后的免疫球蛋白粗品；2.5DEAE‑纤维素纯化免疫球蛋白活化处理DEAE‑纤维素后装柱，用吸管将已脱盐的免疫球蛋白粗品沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床；用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的免疫球蛋白，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，并置于‑20℃保存；步骤3）配置肠溶兽用二联免疫增强剂将抗菌肽和免疫球蛋白分别低温真空干燥后，制成干粉，将两者按1：2合并，充分混合均匀，并加入辅料甘氨酸、蔗糖和甘露醇，各种辅料按照质量分数的添加量分别为氨酸添加量4%，蔗糖添加量3%，甘露醇添加量3%。