一种微生物角蛋白酶的分离纯化及应用方法

摘要

本发明公开了一种副短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis CGMCC 10798角蛋白酶的分离纯化方法及应用。通过对一株副短短芽孢杆菌进行发酵培养，并对发酵液上清液采用硫酸铵沉淀和阴离子层析等步骤进行酶纯化，获得了SDS‑PAGE电泳均一的副短短芽孢杆菌角蛋白酶，该纯酶的比酶活为6605.48U/mg，纯化倍数为13.18倍。获得的角蛋白酶对表面活性剂耐受性好、对角蛋白活力高、对胶原蛋白无酶活。本工艺特异性高，操作条件温和，步骤简洁，纯化效果好，回收率高，成本低，易于扩大化。本发明所获得副短短芽孢杆菌角蛋白酶在制革脱毛领域和促进药物吸收方面具有良好的应用前景。

主权项

一种微生物角蛋白酶的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子培养：将2015年5月11号保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10798，分类命名为副短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis进行划线活化，分离出单菌落；挑取单菌落接入LB种子培养基中，在37℃条件下培养12h；(2)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，摇床培养；发酵培养基按：角蛋白10g/L，可溶性淀粉10g/L，玉米粉10g/L，NaCl 1.5g/L，NH₄Cl 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.3g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1g/L；(3)粗酶液的制备：在发酵培养基中定期取样检测酶活，在角蛋白酶活性达到最高值时取发酵液离心去除菌体，上清液采用真空抽滤，收集菌液；(4)硫酸铵沉淀：向滤液中缓慢加硫酸铵粉末并搅拌至其硫酸铵浓度达到40％饱和度，于4℃静置过夜；4℃，10000rpm离心30min收集上清；向上清中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵浓度达到70％，于4℃静置过夜；10000rpm离心30min收集沉淀；用10mM，pH 8.5的Tris‑HCl缓冲液将沉淀复溶，然后用缓冲液进行透析，期间更换缓冲液3次直至透析完全；透析结束后，10000rpm离心30min去除不溶杂蛋白，收集上清液待纯化；(5)阴离子交换层析：将步骤(4)得到的上清液上样到阴离子交换柱中，用10mM，pH 8.5的Tris‑HCl缓冲液进行平衡，再用0.6M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，并通过检测UV280nm收集第二个洗脱峰；(6)将步骤(5)用10mM，pH 8.5的Tris‑HCl缓冲液透析去盐后超滤浓缩，得到角蛋白酶。