一株高产酯酿酒酵母菌株及其启动子无缝插入方法

摘要

本发明公开了一株高产酯酿酒酵母菌株及其构建方法，所述高产酯酵母菌株通过将强启子PGK1p精确插入亲本酵母菌株醇乙酰基转移酶基因(ATF1)ORF的5′端来获得，启动子的精确插入通过融合PCR和酵母整合质粒YIplac211来实现。构建得到的高产酯酵母，在其他发酵性能不受影响的情况下，ATF1的mRNA表达量和醇乙酰基转移酶产量分别是出发菌株的40和5倍；玉米浓醪发酵4天，总酯产量是亲本的2.7倍，乙酸乙酯的产量是亲本菌株的3.1倍。本发明构建的酵母菌中基因组上无外源基因残留，因此可以安全的用于工业生产。

主权项

一株高产酯的酿酒酵母菌株，是在酵母出发菌株中将强启动子PGK1p精确插入醇乙酰基转移酶基因ATF1的5′端获得，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，启动子是通过融合PCR介导的两步整合法无缝插入实现的，包括如下步骤：(1)PCR获得突变ura3片段；将该片段导入出发菌株中，获得缺陷型菌株；(2)以菌株CICC 32315的基因组为模板，PCR分别扩增强启动子PGK1p，插入位点上游和下游同源臂序列，并通过融合PCR将三个片段无缝连接，将融合片段克隆至酵母整合质粒上，获得整合过表达质粒；所述上游同源臂序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，下游同源臂序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；(3)在整合过表达质粒的上游同源臂序列中，选择单一酶切位点，将质粒酶切线性化；(4)将步骤(3)获得的线性质粒导入(1)中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选，获得第一步整合重组的酵母突变株；(5)将步骤(4)中筛出的突变株经5‑氟乳清酸合成培养基反向筛选获得第二步整合重组的酵母突变株；(6)以菌株CICC 32315的基因组为模板，PCR获得正常的URA3基因片段，将其导入到步骤(5)中二步整合重组的酵母突变株中，以回复突变的ura3标记基因，即得所述高产酯的酿酒酵母菌株；所述ATF1基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述强启动子PGK1p其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。