小环DNA载体制剂及其制备方法和使用方法

摘要

本发明提供用于给予对象的小环核酸载体制剂，该小环核酸载体包含感兴趣的多核苷酸、单向位点特异性重组酶的产物杂交序列且没有质粒骨架细菌DNA序列。还提供制备所述制剂的方法，以及将所述小环核酸载体制剂给予对象的方法。本发明的方法和组合物可用于各种不同应用，包括研究和治疗应用。

主权项

一种小环核酸载体制剂，其包含：含有感兴趣多核苷酸和单向位点特异性重组酶的产物杂交序列的小环核酸载体，限制性条件是该小环核酸载体没有质粒骨架DNA序列；和药学上可接受的赋形剂，该制剂中基本上没有污染性核酸，并且，该制剂所含的核酸至少99％为小环核酸载体；并且，所述制剂是用包含以下步骤的方法制备的：用环形亲代质粒转染经遗传修饰缺乏功能性内切核酸酶1且含有在组成型启动子调控下的araE编码序列的细菌细胞，所述环形亲代质粒包含：(i)侧接单向位点特异性重组酶所识别的attB和attP重组位点的感兴趣多核苷酸；(ii)至少一个非所用细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶识别的限制性内切酶位点的；其中，所述细胞基因组内整合了单向位点特异性重组酶的编码序列和非所用细菌细胞内源性限制性内切核酸酶的编码序列，所述细菌细胞还包含突变蛋白LacY A177C的编码序列；培养所述细菌细胞，培养条件和时间足以令单向位点特异性重组酶得以表达并由该单向位点特异性重组酶重组所述attB和attP重组位点，并且，培养条件和时间足以令限制性内切核酸酶得以表达并由该限制性内切核酸酶消化所述限制性内切酶位点，通过培养提供包含感兴趣多核苷酸和所述单向位点特异性重组酶的产物杂交序列的小环核酸载体；纯化这种小环核酸载体，得到基本上没有污染性核酸的小环核酸载体组合物。