提高CRISPR介导的同源重组效率的方法

摘要

本发明公开了一种提高CRISPR介导的同源重组效率的方法，包括如下步骤：通过shRNA抑制Lig4、DNA‑PK和XRCC6的表达从而抑制非同源末端连接(NHEJ)修复途径；将靶向基因组特定位置的sgRNA与shRNA融合表达，形成shRNA‑sgRNA多顺反子；将上述多顺反子置于RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子下游。本发明的方法所构建的载体结构精简、使用方便，并且几十倍的增强了同源重组的效率，极大的扩展了CRISPR载体的功能和应用，是功能基因及信号通路研究、医学研究、重组蛋白表达的良好工具。

主权项

一种提高CRISPR介导的同源重组效率的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：设计靶向Lig4、DNA‑PK和XRCC6促进非同源末端连接途径的基因的shRNA，并将所述shRNA以miRNA的形式串联成多顺反子表达；在需要进行同源重组编辑的目的基因上选取合适的sgRNA靶位点；将所述sgRNA与所述shRNA融合构成shRNA‑sgRNA多顺反子，将所述多顺反子置于RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子下游构建表达载体；将所述sgRNA两侧设定范围作为重组臂，中间插入目的基因，其中，所述重组臂的序列和细胞基因组上特定位置的序列相同且用于引发与细胞基因组之间的同源重组，所述插入基因是插入位置处原本的基因的修饰或是需要外源表达的新的基因；将所述表达载体与Cas9表达载体以及含重组臂的donor载体共转染动物细胞，以通过转录形成pri‑shRNA‑sgRNA；将所述pri‑shRNA‑sgRNA在动物细胞中被Drosha和Dicer加工，所述加工过程具体包括：sgRNA和pre‑shRNA分别释放出来，其中sgRNA的部分与Cas9装配形成位点特异性核酸内切酶，进而识别相应的靶位点，对相应的基因进行编辑；pre‑shRNA则被加工进入RISC复合物成为成熟的shRNA，以抑制NHEJ途径的活性。