一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法

摘要

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法。具体方法：以暗培养7天的芥菜下胚轴为外植体，利用载有目标基因载体的农杆菌侵染下胚轴，通过共转化，诱导培养愈伤组织，抗性筛选，脱分化等过程，成功获得转基因阳性苗。通过对阳性苗的PCR鉴定证明将目标基因成功的转到植物中表达。本发明建立了一个芥菜高效的再生体系，为研究芥菜农杆菌芥导的转基因技术做好基础。

主权项

一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，包括下述步骤：1）.将灭菌后的芥菜种子置于M0培养基中，暗培养5‑7天，长成芥菜黄化苗；MO培养基：MS培养基 2.2‑2.4 g/L + 琼脂粉 2.5g/L ；2）.切取芥菜黄化苗下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.8‑1.0cm小段，切取过程中保证切口平整，将其置于DM培养液保湿；DM培养液的配方包括：MS培养基 4.4‑4.6 g/L +蔗糖 30 g/L +乙酰丁香酮 100mg/L；3）. 利用常规方式将含有目的基因表达载体的农杆菌菌液侵染外植体；4）. 将被侵染后的外植体转到M1培养基中，黑暗条件共培养40‑48h后，将M1上的外植体转入M2培养基中，光照条件下进行培养；M1培养基的配方包括：MS 4.4g/L+蔗糖 30 g/L+甘露醇18g/L +2,4‑D 1mg/L+激动素0.3mg/L +乙酰丁香酮 100mg/L+琼脂糖 6g/L；M2培养基的配方包括：MS 4.4g/L+蔗糖 30g/L+甘露醇 18g/L+ 2,4‑二氯苯氧乙酸 1mg/L+激动素0.3mg/L+卡那霉素50mg/L +琼脂糖 6g/L+亚硫酸钠和硝酸银形成的络合物 0.1mol/L+特美汀 100mg/L；5）. 三周后将M2培养基中的外植体转入M3培养基中，每3‑4周更换新的M3培养基，直至长出愈伤组织并诱导出现有生长点绿芽，切取含有生长点的绿芽；M3培养基的配方包括：MS 4.4g/L+葡萄糖 10g/L+木糖 0.25g/L+MES 0.6g/L+琼脂糖 6g/L+反式玉米素 2mg/L+特美汀 100mg/L+生长素 0.1mg/L+卡那霉素 25mg/L；6）. 将含有生长点的绿芽转入M4培养基中进行生根培养，25‑35天即可移入小花砵中炼苗生长；M4培养基的配方包括：MS 4.4‑4.6 g/L +琼脂糖 10g/L；以上过程保证无菌操作，黑暗条件培养和光照条件培养都在光照培养室中进行；所有培养基的pH都调至5.8‑6.0之间；所述的光照条件培养：16h光照，800‑1000 Lux, 8h黑暗，温度25℃。