一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法，其特征在于：所述方法中使用的培养基中仅含有低浓度的胎牛血清，利用表皮角质形成细胞和黑素细胞耐受蛋白酶消化液的时间不同，达到分离两种细胞的目的；培养的过程弃用动物来源的细胞消化液，转而采用植物来源的细胞消化液。本发明的培养过程不会带入其他动物来源的因素和/或有害性物质的选择培养方法。因而，该方法降低了临床应用的风险。

主权项

一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取健康人群外科手术后1小时内丢弃的皮肤作为材料；将材料置于无菌平衡盐溶液中，修剪掉血块和皮下脂肪；2)将步骤1)中得到的经过修剪后的材料使用无菌平衡盐溶液进行漂洗1～3次；3)将步骤2)中得到的经过漂洗后的材料剪成2mm宽的长条；将修剪成长条状的材料置入浓度为0.25％的EDTA中，在4℃条件下消化8～12小时；4)将步骤3)中得到的消化后的材料通过镊子分离表皮和真皮，取表皮，将表皮通过无菌平衡盐溶液进行漂洗3次；5)将步骤4)中得到的表皮剪成若干个2mm×2mm的片状结构；将片状结构置于浓度为0.25％的TrypLE^TM中，在37℃条件下消化20min，得到混合物A；6)向混合物A中加入无菌平衡盐溶液，得到细胞悬液；所述无菌平衡盐溶液的体积是混合物A的两倍；7)将步骤6)中得到的细胞悬液通过200目筛网进行过滤，离心，收集沉淀；8)将步骤7)中收集到的沉淀重悬于黑素细胞培养基中；9)将步骤8)中的黑素细胞培养基中的细胞密度调整至1×10⁵个/mL后，将细胞接种于培养瓶中；10)将步骤9)中的培养瓶置于37℃条件下，浓度为5％的CO₂培养箱内进行培养，6h后更换培养基去除未贴壁细胞；11)待步骤10)中经过更换培养基后的细胞长至80％满时，将细胞置于浓度为0.25％的TrypLE^TM中，消化3～10分钟，得到分离纯化后的黑素细胞；12)将步骤11)中得到的分离纯化后的黑素细胞，按照1︰2～1︰3进行接种，传代培养；13)待步骤12)中得到的分离纯化后的细胞生长至足够临床移植后，留存备用。