一种基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法

摘要

本发明公开一种基于分光光度法的检测活芽孢含量的高通量检测方法，利用芽孢一旦遇到合适的环境，就会迅速萌发，从休眠状态转化为营养生长状态后芽孢折光性很强，而在萌发过程中，这些多层结构吸水膨胀、折光性消失，导致光吸收下降。本发明以光吸收下降作为芽孢萌发活性的表征，用于评价芽孢繁殖活力的大小，可以大大简化活芽孢含量检测流程，克服传统方法检测工作量大、周期长和成本高等问题。

主权项

一种基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法，其步骤是：a)高存活率萌发芽孢的制备：针对待测菌种，采用合适的培养条件进行培养并制备高存活率的萌发芽孢水悬液，调整其OD₄₉₀值为0.5‑1.7；采用传统活菌菌落计数法检测该芽孢悬液的活芽孢浓度；b)非萌发芽孢的制备：选择一种在待测菌种芽孢萌发条件下不能萌发的产芽孢菌种作为非萌发芽孢的来源，进行培养，制备两种不同芽孢浓度的非萌发芽孢水悬液：一种的OD₄₉₀与高存活率待测芽孢水悬液相同，用于制备标准曲线；另一种芽孢浓度高达1×10¹⁰‑5×10¹⁰个/ml，用作待测样品的光密度调节剂；c)标准曲线的制备：将上述萌发芽孢水悬液和非萌发芽孢水悬液以不同体积比混匀，制备含有梯度浓度萌发芽孢的芽孢悬浮液，其活的萌发芽孢浓度根据体积比与(a)步骤中所获得的萌发芽孢水悬液活芽孢浓度计算获得，将以上含有梯度浓度萌发芽孢的不同芽孢悬浮液放入水浴锅热激处理，60‑80℃加热10‑30分钟，热激处理后分别取50‑150μL加入多孔板中，再加入一定体积萌发缓冲液，混匀，制成萌发反应液，利用酶标仪检测反应液的初始OD₄₉₀值，之后将多孔板放于28‑37℃恒温培养箱中反应1.5‑3小时后，检测终点OD₄₉₀值，计算不同浓度萌发芽孢的芽孢悬浮液的OD₄₉₀下降值，以OD₄₉₀下降值为横坐标，相应的活的萌发芽孢浓度作为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合获得标准曲线公式；d)待测样品的预处理：若待测样品为粉剂，用去离子水在离心管或试管中将芽孢制成水悬液，通过调整去离子水的加入量，将芽孢悬液调至OD₄₉₀值与步骤(a)中高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等；若待测样品为水悬液而且OD₄₉₀小于0.5，则向该芽孢悬液中加入光密度调节剂使其OD₄₉₀值与步骤(a)中高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等；若芽孢制品为水悬液而OD₄₉₀大于1.7，则向该芽孢悬液中加去离子水使其OD₄₉₀值与步骤(a)中高存活率萌发芽孢水悬液OD₄₉₀值相等，将盛有待测芽孢悬浮液的离心管或试管放入水浴锅，60‑80℃加热10‑30分钟；e)待测样品的萌发反应：分别取与标准曲线制备中芽孢悬浮液相同体积的该待测芽孢悬浮液加入多孔板中作为实验组；将剩余芽孢悬液4000‑6000g离心5‑15min，分别取等体积上清液加入多孔板中作为对照组；向各孔中加入一定体积芽孢萌发缓冲液，混匀；f)光密度值检测与光密度下降值计算：利用酶标仪检测实验组和对照组中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值；检测完成后，将多孔板放于30℃恒温培养箱中培养1.5‑3小时，期间每隔30分钟混匀1次，培养完成后，利用酶标仪检测实验组和对照组的芽孢萌发反应液的终点OD₄₉₀值，按照以下公式计算OD₄₉₀下降值ΔOD₄₉₀，将ΔOD₄₉₀值代入步骤c所获得的标准曲线公式，计算获得活芽孢含量；ΔOD₄₉₀＝(ΔOD₁+ΔOD₂+ΔOD₃)÷3－(ΔOD_C1+ΔOD_C2+ΔOD_C3)÷3其中ΔOD_n为实验组第n个孔中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值与终点初始OD₄₉₀的差值；ΔOD_Cn为对照组第n个孔中芽孢萌发反应液的初始OD₄₉₀值与终点初始OD₄₉₀的差值。