一种基于磁性微珠的低场NMR稀有细胞检测方法

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于磁性微珠的低场NMR稀有细胞检测方法，包含以下步骤：(1)分别制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，使核磁共振造影剂与样本中的稀有细胞进行免疫反应富集，除去未反应的核磁共振造影剂，得到核磁共振造影剂富集的标准样本和待测样本；(3)用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定，并以无菌的去离子水或缓冲液作为空白对照；(4)计算弛豫时间改变量，绘制成标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的含量。本发明可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测生物体液样本中含量较低的稀有细胞。

主权项

一种基于磁性微珠的低场NMR稀有细胞检测方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递经洗涤离高心重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本；(2)核磁共振造影剂亲和富集取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，使核磁共振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集，然后除去未反应的核磁共振造影剂，得到核磁共振造影剂富集的标准样本；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，使核磁共振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集，然后除去未反应的核磁共振造影剂，得到核磁共振造影剂富集的待检样本；控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时间3～5s；使核磁共振造影剂分别与标准样本、待检样本中的稀有细胞发生免疫反应 富集的反应条件为：混合均匀后在4～8℃温度下孵育10～15min；核磁共振造影剂加入量为：每200个目标稀有细胞中加入1微升核磁共振造影剂；(3)核磁共振弛豫时间检测取上述核磁共振造影剂富集的标准样本，用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T_sample；以缓冲液作为空白对照，用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T_blank；取上述核磁共振造影剂富集的待检样本，用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T_test；(4)标准曲线制作与结果得出计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T_sample‑T_blank，以ΔT2为纵坐标，以标准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线；计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T_test‑T_blank，ΔT2_test不为0，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有细胞的含量步骤(2)中所使用的核磁共振造影剂为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠。