一种抗人降钙素原蛋白N末端抗原表位的单克隆抗体7H8的制备

摘要

本发明公开了一种分泌抗人PCT蛋白N末端氨基酸序列的单克隆抗体7H8的杂交瘤细胞，通过在大肠杆菌中原核表达密码子优化后的人PCT全基因序列，以纯化的人PCT蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合及筛选，获得了能够稳定分泌针对人PCT蛋白N末端抗原表位单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为7H8。7H8单克隆抗体能够应用于血清PCT浓度的检测，并且具有高度的灵敏度和特异性。7H8抗体识别人PCT蛋白N末端氨基酸序列，避免了与体内降钙素发生交叉反应，提高识别PCT蛋白的特异性，为开发PCT相应的诊断试剂提供了一种很好的新材料，可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。

主权项

一种抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）将人PCT蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只小鼠免疫蛋白浓度分别为30 µg、50 µg、100 µg和150 µg四个梯度的剂量，每个梯度免疫3只6~8周龄BALB/c雌性小鼠；其中所述的人PCT蛋白由如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列所编码；（2）两周后进行第2次免疫，将人PCT蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；（3）2周后分别进行第3次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；（4）融合前3 d用不加佐剂的人PCT抗原，采用皮下加强免疫，每只剂量为100 μg；（5）融合前1 d用不加佐剂的人PCT抗原加强免疫，每只剂量50 μg；（6）小鼠眼角进行采血，4 ℃，4000 g离心5 min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1,000,000的小鼠准备进行细胞融合试验；（7）选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5~1:10混合，1500 g离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清；（8）轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1 mL 37 ℃预热的PEG 1500并轻轻混匀1.5 min，然后加入20 mL 1640培养基；（9）800 g离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，细胞中加入含有20%血清的HAT‑1640培养基并混匀；（10）将混匀细胞均匀铺于96孔板中，在37 ℃，CO₂浓度为5%的细胞培养箱中培养5~7 d后观察融合效果并换液；（11）换液后第4 d用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液，选择阳性值高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，每孔细胞数目理论值为1~2个；（12）经过3~4次亚克隆后，即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；(13) 进一步筛选和鉴定能够分泌识别的表位位于PCT蛋白的N末端氨基酸，而不识别降钙素（CT）的氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。