人sB7‑H4真核表达蛋白质单体的制备方法

摘要

本发明涉及生物技术和分子生物学技术领域，具体涉及人sB7‑H4真核表达蛋白质单体的制备方法。该人sB7‑H4真核表达蛋白质单体的制备方法，是通过对密码子进行优化，并在N端插入人IgFc作为纯化标签，且在融合蛋白的N端插入人工引导序列，实现蛋白的高效可溶性分泌表达。本发明所制备的人sB7‑H4真核表达蛋白质单体可用于作为抗原免疫动物制备抗体，也可用于作为检测人sB7‑H4的参考标准品，同时还可以作为B7‑H4的诱骗受体，竞争抑制B7‑H4信号通路，用于肿瘤等免疫性疾病的治疗。

主权项

人sB7‑H4真核表达蛋白质单体的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一，基因序列确定、密码子优化和基因合成：选择人sB7‑H4基因序列，通过全基因合成的方式合成表达人sB7‑H4全长基因；采用人IgF c作为标签，并插入FLAG/EK蛋白酶酶切位点，前端插入人工信号肽，并根据载体和表达细胞的特性对密码子进行优化；以pcDNA3.1作为表达载体在293‑T细胞中进行表达；步骤二，载体构建和质粒提取：（1）基因合成：对步骤一所合成表达的人sB7‑H4胞外功能区全长基因，在5’端加入EcoRI酶切位点，3’端加入HindIII酶切位点，目的片段双酶切后连接入pcDNA3.1载体中；（2）目的片段与空载体双酶切：分别向目的片段和空载体中加入EcoRI和HindIII进行双酶切反应；（3）目的片段与载体连接：双酶切后用T4 DNA 连接酶连接目的片段和载体质粒，在离心管中配置连接反应液，用移液器吹打混匀连接反应物，并进行常温反应一定时间；（4）转化感受态细胞Trans1 T1；（5）鉴定：进行阳性菌落的PCR鉴定，然后将通过菌液PCR检测的阳性菌液进行测序，将步骤（3）目的片段与载体连接步骤中得到的序列与步骤一合成的人sB7‑H4全长基因序列进行对比分析，确定其是否为目的基因；（6）无内毒素质粒抽提：按照E.Z.N.A. ® Endo‑free Plasmid Maxi Kit（Omega）试剂盒说明书进行无内毒素质粒抽提，并低温保存；步骤三，细胞培养和转染：（1）细胞复苏；（2）细胞培养；（3）细胞瞬时转染；步骤四，蛋白质表达和纯化：（1）蛋白表达与鉴定：sB7‑H4蛋白质在293‑T和CHO细胞中进行表达，并对所表达的sB7‑H4蛋白质进行鉴定；（2）蛋白酶切；（3）蛋白纯化。