一种高效基因敲除载体的构建方法及构建的工程菌

摘要

本发明提供了一种高效基因敲除载体的构建方法,本发明利用了高效负筛选标记基因与USER酶克隆技术，在载体中构建酶切位点，使载体在酶切后可以产生与USER酶酶切后的目的基因上下游片段互补的粘性末端，同时在载体中还构建了高效负筛选标记基因，并将构建的载体成功用于大丽轮枝菌V592目的基因的敲除，实验证明，利用本发明方法构建的载体大大缩短了大丽轮枝菌目的基因的研究周期，加快了大丽轮枝菌功能基因的研究。

主权项

一种高效基因敲除载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤：(1)将带有HSV‑tk基因的载体PGKO‑Gateway通过Xba Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收酶切后的载体大片段；(2)将载体Psul‑EGFP通过Xba Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收酶切后的载体短片段；(3)连接步骤(1)和步骤(2)中获得的所述载体大片段和所述载体短片段，获得载体PGKO‑EGFP；(4)将所述载体PGKO‑EGFP用Smal Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，回收含有Hind Ⅲ和Smal Ⅰ酶切位点的载体片段；(5)以载体pRF‑HU2为模板通过引物prf‑pgko‑s和prf‑pgko‑a扩增带有Nt.BbvCI和Pac Ⅰ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段；(6)回收步骤(5)的扩增产物直接与步骤(4)中所述含有Hind Ⅲ和Smal Ⅰ酶切位点的载体片段进行酶切连接；(7)步骤(6)的产物转化受体菌，选取经验证的阳性克隆的质粒即为所述高效基因敲除载体。