一种基于电位寻址模式的双肿瘤标志物的光电检测方法

摘要

本发明公开一种基于电位寻址模式的双肿瘤标志物的光电检测方法。该方法利用在光电检测过程中，调制传感界面上的应用电位，即可实现对白细胞介素‑6和前列腺特异抗原等两种肿瘤标志物的高灵敏检测。通过将聚酰胺胺和TiO₂介观晶体相复合，分别修饰于双圆盘电极界面上，形成基质层，然后分别修饰上白细胞介素‑6和前列腺特异抗原。分别在纳米石墨相氮化碳及壳聚糖‑碘化银纳米粒子上功能化白细胞介素‑6抗体和前列腺特异抗原抗体，进而制备了针对白细胞介素‑6和前列腺特异抗原的纳米光电化学探针。结合竞争免疫分析策略，所制备的光电化学探针能与目标物竞争结合于电极基质上。可实现对于同种测试样品中的两种肿瘤标志物的电位寻址型光电化学检测。

主权项

一种基于电位寻址模式的双肿瘤标志物的光电检测方法，其特征在于，包括以下步骤：双圆盘玻碳电极（DDCE）的预处理：DDCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；PAAD@CAM/DDCE修饰电极的制备：将100μL浓度为3mg/ml的二氧化钛介观晶体（CAM）溶液与100μL浓度为0.5wt%的聚酰胺胺溶液相混合，超声3个小时；在3000转/分钟的转速下将该溶液离心，去除上清液，随后加入200μL超纯水，摇匀，获得均一的修饰溶液；分别滴加4μL该修饰溶液于双圆盘玻碳电极上，红外灯下烘干，冷却至室温，即得到PAAD@CAM/DDCE修饰电极；通过将该PAAD@CAM/DDCE修饰电极浸泡于浓度为5.0 wt. %的戊二醛溶液中50分钟，然后分别在两个PAAD@CAM/DDCE修饰电极滴涂20 μL 浓度为1 ng mL^‑1前列腺特异抗原和 20 μL of 1 ng mL^‑1白细胞介素‑6，作用45分钟后，依次用清水清洗，随后，将该修饰电极浸入浓度为1.0 wt.%的牛血清白蛋白 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点；用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得修饰电极；前列腺特异抗原的抗体功能化的光电化学探针（Ab₁@g‑C₃N₄）：混合100 μL 浓度为0.5wt% 的壳聚糖溶液与1 mL浓度为3 mg mL^‑1 的石墨相氮化碳（g‑C₃N₄）溶液，超声48 小时,将该溶液在6000转/分钟的转速下离心20分钟，移除上清液，获得沉淀，烘干；将3mg该沉淀物分散于1mL二次水溶液，即得到浓度为3 mg mL^‑1的壳聚糖‑石墨相氮化碳光电化学探针，移取120 μL浓度为0.3 mg mL^‑1 的壳聚糖‑石墨相氮化碳溶液与20 μL 前列腺特异抗原的抗体相混合，然后滴加30 μL浓度为 0.5wt% 的戊二醛溶液，室温下反应3小时，随后将该溶液在6000转/分钟的转速下离心20分钟，移除上清液，获得沉淀；然后再加入1mL磷酸盐缓冲溶液，超声分散，即获得前列腺特异抗原的抗体功能化的光电化学探针（Ab₁@g‑C₃N₄）；白细胞介素‑6抗体功能化的光电化学探针（Ab₂@CS‑AgI）：混合100 μL 浓度为0.5wt% 的壳聚糖溶液与1 mL浓度为3 mg mL^‑1 的纳米碘化银（AgI）溶液，超声48 小时，将该溶液在6000转/分钟的转速下离心20分钟，移除上清液，获得沉淀，烘干，将3mg该沉淀物分散于1mL二次水溶液，即得到浓度为3 mg mL^‑1的壳聚糖‑纳米碘化银光电化学探针；移取120 μL浓度为0.3 mg mL^‑1 的壳聚糖‑纳米碘化银溶液与20 μL 白细胞介素‑6抗体相混合，然后滴加30 μL浓度为 0.5wt% 的戊二醛溶液，室温下反应3小时，随后将该溶液在6000转/分钟的转速下离心20分钟，移除上清液，获得沉淀，然后再加入1mL磷酸盐缓冲溶液，超声分散，即获得前列腺特异抗原的抗体功能化的光电化学探针（Ab₂@CS‑AgI）；白细胞介素‑6和前列腺特异抗原的检测：采用三电极体系进行测定，以所构建步骤（2）所获得的白细胞介素‑6和前列腺特异抗原的PAAD@CAM/DDCE修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，结合竞争免疫分析策略，固载于PAAD@CAM/DDCE修饰电极上的白细胞介素‑6和前列腺特异抗原，分别与待测溶液中的白细胞介素‑6和前列腺特异抗原竞争结合，放入待测溶液中的步骤（3）所制得的前列腺特异抗原的抗体功能化的光电化学探针（Ab₁@g‑C₃N₄）用于结合固载于PAAD@CAM/DDCE修饰电极上的前列腺特异抗原和待测溶液中游离的前列腺特异抗原，放入待测溶液中的步骤（4）制得的白细胞介素‑6抗体功能化的光电化学探针（Ab₂@CS‑AgI）用于结合固载于PAAD@CAM/DDCE修饰电极上的白细胞介素‑6和待测溶液中游离的白细胞介素‑6；分别设置电压为+0.12V和‑0.135V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 7.4的 PBS缓冲溶液中，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，在+0.12V电压下，可绘制针对前列腺特异抗原的工作曲线；在‑0.135V电压下，可绘制针对白细胞介素‑6的工作曲线，检测的结果可通过工作曲线查得。