一种猪嵴病毒全长cDNA的构建方法

摘要

本发明公开了一种猪嵴病毒全长cDNA的构建方法，通过分析从流行病学调查中选出的在腹泻仔猪中较流行的PKV CH441株基因组和pBlueScript KS(Ⅱ)载体结构，对PKV CH441株基因组进行了分段RT‑PCR扩增并克隆在pBlueScript KS(Ⅱ)载体上，成功构建了包含有PKV全长的质粒，该研究为了解PKV在细胞中的复制机制，研制疫苗奠定了夯实的基础。

主权项

一种猪嵴病毒全长cDNA的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1利用Primer premier 5软件对拼接后CH441株全基因组序列和pBlueScript KS(Ⅱ)载体进行序列分析，选择了载体和全基因组中都单一存在的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ，在全基因组中单一存在的MefⅠ及载体上不存在但通过引物在序列3’末端引入的Pac Ⅰ酶切位点以及虽然全基因组序列上不止一个但可以通过调整顺序插入的Sac Ⅰ和Cla Ⅰ酶切位点；利用这些酶切位点将全基因组连接在同一载体上；S2片段P1与pBlueScript KS(Ⅱ)载体连接:将已克隆到pMD19‑T Simple Vector载体上测序正确的pMD19‑T‑P1质粒用Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶双酶切，反应体系为：10×NEB buffer 5μL；Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶各2μL；pMD19‑T‑P1质粒10μL；去离子水31μL，混匀后37℃作用2h，回收后的片段与用相同的限制性内切酶酶切的pBlueScript KS(Ⅱ)纯化回收产物用T4DNA连接酶进行连接，10μL反应体系如下：2×T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，载体1μL，P1片段7μL，混匀并16℃连接过夜后进行转化；次日挑取单菌落培养后，用Plasm id Mini KitI提取质粒，选出双酶切鉴定呈阳性的质粒送测序；将测序结果与已获得的PKV CH441株对应序列进行比对分析，测序正确的质粒命名为pBKS‑P1；S3 P2片段与pBKS‑P1的连接:测序正确的pBKS‑P1用EcoR Ⅰ和Cla Ⅰ限制性内切酶双酶切处理。回收后的片段与用相同方法处理的pMD19‑T‑P2回收产物用T4DNA连接酶进行连接，连接过夜后进行转化。挑选单菌落培养后提取质粒，选出双酶切鉴定呈阳性的质粒送测序；测序正确的质粒命名为pBKS‑P1‑P2；S4 3’片段与pBKS‑P1‑P2的连接:测序正确的pBKS‑P1‑P2用Mef Ⅰ和Cla Ⅰ限制性内切酶双酶切处理。目的片段回收后与用相同方法处理的pMD19‑T‑3’回收产物用T4DNA连接酶连接过夜后进行转化；挑选单菌落培养后提取质粒，选出双酶切鉴定呈阳性的质粒送测序；将测序结果与已测得的PKV CH441株对应序列进行比对分析，测序正确者命名为pBKS‑P1‑P2‑3’；S5 P3片段与pBKS‑P1‑P2‑3’的连接:测序正确的pBKS‑P1‑P2‑3’用Mef Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶双酶切处理。回收后的片段与用相同方法处理的pMD19‑T‑P3回收产物连接过夜后进行转化；挑选单菌落培养适当时间后提取质粒，选出双酶切鉴定呈阳性的质粒送测序；测序结果与已测得的PKV CH441株对应序列进行比对分析，测序正确的质粒命名为pBKS‑P1‑P2‑3’‑P3；S6将测序合适的pBKS‑P1‑P2‑3’‑P3质粒用Pac Ⅰ限制性内切酶单酶切，酶切反应在50μL体系中进行：10×NEB buffer 5μL；Pac Ⅰ5μL；pBKS‑P1‑P2‑3’‑P3质粒10μL；去离子水30μL，混匀后37℃作用2h，然后进行纯化回收；S7回收的片段进行体外转录。