简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法

摘要

本发明公开了一种简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，包括引物设计、PCR扩增Bm‑myosin基因、Bm‑myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化、阳性重组克隆的筛选和鉴定、Bm‑MYOSIN二级结构预测、Bm‑MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测、Bm‑MYOSIN T细胞表位预测、表位基因片段的选择、目的基因片段原核表达载体构建、rBmM29重组蛋白表达和纯化等步骤。本发明方法简便、效果好。

主权项

一种简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：包括下列步骤：(一)引物设计根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’GGA TCC序列为BamHⅠ酶切位点；Tm＝56.84P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’CTC GAG序列为XhoⅠ酶切位点；Tm＝66.90；(二)PCR扩增Bm‐myosin基因P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix 4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(三)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离心,8000rpm 5min；弃上清,加入冰浴的0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm5min,弃上清,加入冰浴的0.1mol/L CaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；(4)转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal、IPTG和Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；(四)阳性重组克隆的筛选和鉴定(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与Xho Ⅰ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；(4)测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面测序；(五)Bm‐MYOSIN二级结构预测分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；(六)Bm‐MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；(七)Bm‐MYOSIN T细胞表位预测(1)人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(2)鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(3)人源HLAⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301和HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；(4)鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；(八)表位基因片段的选择根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29；应用Primer 5软件设计引物；上游P1：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’其中下划线序列为BamHⅠ酶切位点；下游P2：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT其中下划线序列为EcoRⅠ酶切位点；引物使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L；(九)目的基因片段原核表达载体构建A、菌种活化和扩增(1)取保存于‐80℃的菌种，用接种环划菌于1.5％含Amp的琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；(2)挑取单菌落，接种于4ml含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温，220rpm振荡培养12‐14h；B、pET‐28a(+)质粒小量抽提(1)取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清；(2)加250μl悬浮液Buffer S1充分悬浮细菌沉淀至无小菌块；(3)加250μl裂解液Buffer S2，温和并充分地上下翻转4‐6次，使菌体充分裂解；(4)加350μl中和液Buffer S3，温和并充分地上下翻转6‐8次，12000rpm离心10min；(5)吸取步骤4中的上清，转移到制备管，12000rpm离心1min，弃滤液；(6)向制备管中加500μl去盐液Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液；(7)向制备管中加700μl洗涤液Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；重复该步骤一次；(8)将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min；(9)将制备管移入新的1.5ml离心管，在制备管膜中央加60μl洗脱液Eluent，室温静置1min；12000rpm离心1min；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；C、表位基因片段PCR扩增以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系见表1；表1 PCR扩增反应体系扩增反应参数为：取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因；胶回收(1)切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用面纸吸尽凝胶表面液体，放到1.5ml离心管中，用镊子夹碎；计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE‐A，75℃加热6‐8min，间断混合，直至凝胶块完全熔化；(3)加入0.5个Buffer DE‐A体积的Buffer DE‐B，上下颠倒混合均匀；(4)吸取步骤3中的溶液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；(5)向制备管中加500μl Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液；(6)向制备管中加700μl Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液；再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000rpm离心1min；(7)将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1min；(8)将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl Eluent，室温静置1min；12000rpm离心1min，管中的溶液即为回收的DNA溶液；D、目的基因与载体连接与鉴定①PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系见表2表2 双酶切反应体系目的基因与载体连接，具体反应体系见表3；表3 目的基因与载体连接反应体系混匀，室温反应30min以上，产物用于转化；②E.coli DH5α感受态细胞的制备(1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养14‐16h至单菌落出现；(2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养10‐12h；(3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min；(4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min；(5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min；(6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min；(7)用2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃；③转化及鉴定(1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；(2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动；(3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min；(4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min；(5)5000rpm离心1min；(6)弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h；(7)用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间；(8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应；(9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定；E、核酸序列测序鉴定:选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序；(十)rBmM29重组蛋白表达和纯化A、rBmM29重组蛋白的诱导将重组质粒pET‐BmM29转化至E.coli BL21，菌落PCR鉴定为阳性后，进行诱导表达：(1)将含有重组质粒的BL21接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜；(2)将上述菌液1:100比例转种入100ml LB培养基，200rpm震荡培养至OD600达0.5‐0.8；(3)加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃诱导12h；(4)4℃，6000rpm离心10min收集细菌；(5)加入10ml蛋白纯化结合缓冲液，重悬菌体；(6)200W超声10min，中间间隔10min，再超声10min，至菌液变澄清；(7)4℃，12000rpm离心20min，收集上清；B、重组蛋白的纯化(1)取1ml镍琼脂糖填料置于4ml结合缓冲液中，混匀，静置数分钟后，将上层液体用移液器吸掉；重复该操作1次；(2)将菌体裂解后的上清与镍琼脂糖填料混合后放在冰中，置摇床上孵育1h；(3)将上述混合物转移至柱子中，让液体流出；(4)用4ml洗涤缓冲液洗去杂蛋白，重复该操作1次；(5)用5ml洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱的蛋白；得到的蛋白还进行SDS‐PAGE分析：(1)将胶垫和玻璃板安装固定好；(2)按表4配制10％分离胶3.75ml，加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间，再在胶液面上小心注入异丙醇；(3)待凝胶聚合完全后，倾出覆盖的异丙醇，用滤纸将残留的异丙醇吸尽；(4)另取一只烧杯，按表5配制5％浓缩胶2.5ml，加入TEMED后立即快速旋动混合物，并倒入玻璃板中；(5)立即将梳子插入到浓缩胶内，注意不要有气泡，将凝胶室温静置30min；(6)取出梳子，将凝胶板固定于电泳装置的上缓冲液室，放到下缓冲液室中，向上下缓冲液室加入1×电泳缓冲液；表4 分离胶组份配制表表5 浓缩胶组份配制表(7)上样：将蛋白质分子量标准参照物和样品依次上样；(8)电泳：分离胶电压100V，电泳90min，浓缩胶电压80V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部；(9)考马斯亮蓝染色：小心剥下分离胶凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中，于摇床上摇动1‐2h；(10)将凝胶转移到盛有脱色液的平皿中，于摇床上摇动，每15min换一次液，至背景无色，拍照观察结果；蛋白浓度测定蛋白浓缩后，用紫外分光光度计测定在260nm和280nm波长的OD值，计算蛋白质含量mg/ml＝(1.45×A280‐0.74×A260)×稀释倍数。(十一)BmM29表位基因真核表达载体构建纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的克隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜。取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于LB‐Amp(100mg/ml)平板上,37℃过夜培养。从LB‐Amp(100mg/ml)平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。