水解植物蛋白液中氨基酸的HPLC测定方法

摘要

本发明涉及水解植物蛋白液中氨基酸的HPLC测定方法，本发明在基于高效液相色谱的基础上，用盐溶液做流动相，并且加入了一定的N,N‑二甲基甲酰胺及乙酸来改善色谱峰形和分离度。采用2,4‑二硝基氟苯柱前衍生‑高效液相色谱‑紫外检测法测定HVP液中的氨基酸。配制特殊的盐溶液做流动相，改善峰型，使各氨基酸衍生物分离度好，基质干扰小，从而定量更加准确。此方法分析精度高，特别适用于多种氨基酸混合物，分离好，定量精确。

主权项

水解植物蛋白液中氨基酸的HPLC测定方法，包括如下步骤：(1)衍生缓冲液、平衡缓冲液、衍生试剂的制备：衍生缓冲液：将硼酸、硼砂加入水中溶解混合均匀，制得衍生缓冲液，衍生缓冲液中硼酸质量浓度为0.1～0.5％，衍生缓冲液中硼砂质量浓度为1～4％；平衡缓冲液：将磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠加入水中溶解混合均匀，制得平衡缓冲液，平衡缓冲液中磷酸二氢钾质量浓度为0.1～0.3％，平衡缓冲液中十二水合磷酸氢二钠质量浓度为0.5～3.5％；衍生试剂：体积分数为1～3％的2,4‑二硝基氟苯的乙腈溶液；(2)供试品溶液的制备：将质量浓度为0.1～0.5％的水解植物蛋白液加入步骤(1)制得的衍生缓冲液混匀，然后加入衍生试剂，密封，55～65℃水浴，暗反应30～70min，冷至室温，用平衡缓冲液稀释定容至50mL，用于HPLC测定，水解植物蛋白液、衍生缓冲液、衍生试剂的体积比为：(1～2)：(1～2)：(1～2)；(3)氨基酸标准曲线的绘制取18种氨基酸标准品溶液，取1mL定容在100mL容量瓶中，进入HPLC分析，做出氨基酸标准曲线，进样量10μl；(4)氨基酸的含量测定高效液相色谱实验条件如下：依利特Elite AAK‑C18色谱柱，长×宽＝250mm×4.6mm，厚度为5μm，以乙腈‑水为流动相A，乙酸钠溶液为流动相B，梯度洗脱，流动相比例为：A：B＝5：95体积比，洗脱时间：10‑15min，紫外检测器检测波长为300～360nm，流速为1‑1.5ml/min，柱温为27℃，样品进样量10μl，调用步骤(3)的氨基酸标准曲线，测定氨基酸标准品溶液的高效液相色谱峰面积；以所得标准品峰面积为纵坐标，对应的标准品浓度为纵坐标做标准曲线，计算得线性回归方程；根据标准曲线计算供试品中氨基酸的含量，即得。