一种肿瘤干细胞的分离方法

摘要

本发明公开了一种肿瘤干细胞的分离方法，该方法为将肿瘤细胞消化为单个细胞后，再加入消化酶液孵育数小时；将孵育后的细胞加入含血清的细胞培养液进行贴壁生长；细胞贴壁后换肿瘤干细胞TSC培养基进行培养；当细胞长满后，重复多次前述操作后，将获得的细胞进行微球培养，最终获得的微球即为肿瘤干细胞。本发明首次使用多种消化酶或者结合其他物理应激条件刺激多种肿瘤细胞，可以稳定地获得不同类型的TSC；本发明分离的Muse TSC拥有极强的肿瘤干性，均质性好，稳定，因此该方法的建立使获得不同类型的TSC得以标准化，并且更加简单经济，适合大规模构建TSC库所用，以满足常规肿瘤生物医学基础研究、临床研究以及药物开发等工作需求。

主权项

一种肿瘤干细胞的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将贴壁生长的肿瘤细胞经消化酶液1消化至单个细胞后，终止消化，离心，收集沉淀的细胞；2）将收集的细胞中加入消化酶液2孵育0.5～10h；3）将孵育后的细胞经洗涤，离心，收集沉淀的细胞，加入含血清的细胞培养液，混匀，将细胞接种到细胞培养皿中进行贴壁生长；4）上述细胞贴壁后换肿瘤干细胞TSC培养基进行培养；5）当细胞长满后，重复2～6次步骤1）～4），所获得的细胞称为Muse‑肿瘤细胞；6）Spheroids培养：将上述获得的Muse‑肿瘤细胞接种到细胞培养皿中，采用TSC培养基，使Muse‑肿瘤细胞进行单细胞低密度贴壁生长，当多数细胞形成均一致密的克隆，核质比增大，具有典型的干细胞特性时，去除少数异质化的非肿瘤干细胞，将长满后的Muse‑肿瘤细胞消化成单细胞，使用TSC培养基悬浮至琼脂糖铺垫的或低黏附的细胞培养皿中进行悬浮培养，获得的微球Spheroids即为肿瘤干细胞，称为Muse TSC；所述消化酶液1中的消化酶选自胰蛋白酶、TrypLE、Accutase中的一种；所述消化酶液2选自0.02～0.3%（w/v）的I型胶原酶液、0.02～0.3%（w/v）的IV型胶原酶液、0.1～3U/ml的Dispase分散酶液、0.01～0.3%（w/v）胰蛋白酶液、0.01～1%（w/v）的TrypLE酶液、0.01～1%（w/v）的Accutase酶液中的一种。