一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉籼稻的方法

摘要

本发明提供一种利用PMI(phosphomannose isomerase，磷酸甘露糖异构酶)筛选标记将外源基因导入闭颖授粉籼稻的方法。具体而言，本发明通过含有pCAMBIA1381‑PMI载体的农杆菌菌株EHA105介导，以甘露糖为筛选剂，将外源基因导入到闭颖授粉的籼稻品种9m90中。导入结束后，通过PCR检测鉴定，证实外源基因已导入9m90中。该方法成功实现了闭颖授粉的籼稻品种的遗传转化，且无需使用抗生素或除草剂筛选，在加快性状改良过程同时，避免花粉外传导致的基因漂移，提高了环境友好程度。

主权项

一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉籼稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：步骤1：分离出水稻种子的胚，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；步骤2将所述次级愈伤组织转移至新的诱导培养基进行预培养，以获得愈伤组织；步骤3将步骤2中获得的所述愈伤组织与携带磷酸甘露糖异构酶PMI筛选标记基因的农杆菌接触第一预定时间段；步骤4将步骤3处理后的所述愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基，培养第二预定时间段；步骤5将步骤4处理后的所述愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间段；步骤6将步骤5处理后的所述愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；步骤7将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和步骤8将所述苗转移到生根培养基中生根，其中，所述愈伤组织诱导培养基中[NO₃^‑]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，所述步骤4中将所述愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基包括将所述愈伤组织转移到其上垫有一张或多张无菌滤纸的培养皿中21‑23℃培养48小时，所述无菌滤纸中加入2.5‑3.5mL农杆菌悬浮培养基；所述诱导培养基包括：优化的N6大量元素[NO₃^‑]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L 2,4‑D、30μM氯化钴、8g/L琼脂；所述农杆菌悬浮培养基包括：优化的N6大量元素[NO₃^‑]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L 2,4‑D、20g/L麦芽糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮；所述前筛选培养基包括：优化的N6大量元素[NO₃^‑]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM、B5微量元素、MS(Murashige&Skoog)铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L 2,4‑D、30μM氯化钴、8g/L琼脂、250mg/L羧苄青霉素；所述筛选培养基包括：优化的N6大量元素[NO₃^‑]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、7.5g/L麦芽糖、12.5g/L甘露糖、30μM氯化钴、250mg/L羧苄青霉素、8g/L琼脂；所述分化再生培养基包括：优化的N6大量元素[NO₃^‑]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L CH、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L 2‑(N‑吗啉)乙磺酸(MES)、2.5mg/L CuSO₄、1mg/L KT、1mg/L萘乙酸、AA氨基酸、125mg/L羧苄青霉素、30μM氯化钴、8g/L琼脂；所述生根培养基包括：1/2MS基础盐2.165g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。