一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法

摘要

本发明公开了一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤。本发明采用极性溶剂和非极性溶剂分别萃取烟草茎部极性代谢物和非极性代谢物，采用保留指数和质谱谱图库定性鉴定气相色谱质谱所采集的所有代谢物，采用非靶标定量分析方法定量分析所采集的所有代谢物。该方法的建立为开展烟草茎部代谢组学相关研究提供了重要的参考。

主权项

一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，其特征在于包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：A、样品前处理：将新鲜的烟草茎部样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草茎部样本，于4℃进行保存；B、色谱质谱分离：1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0 mg的冻干烟草茎部样本于1.5 mL离心管，加入370 μL甲醇、480 μL去离子水、450 μL甲基叔丁基醚和200 μL内标溶液，超声，离心，取下清液600 μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 μL甲氧胺溶液，37 ℃恒温肟化90 min，加入80 μL MSTFA，37 ℃恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0 mg冻干烟草茎部样本，加入4.9 mL二氯甲烷和100 μL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：其中，C_x和C₁分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；A_x和A₁分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。