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一种提取烟草衰老叶片总RNA的方法，其特征在于能从衰老烟草叶片中获得高质量的RNA，包括以下步骤：（1）样品收集：分别选取衰老时期的烟草上、中、下部叶若干片，以主叶脉为界剪取一半迅速液氮速冻后‑80℃保存；（2）取相同叶位的5‑8个叶片在大研钵中液氮混合研磨至粗粉末后，取一部分转入小研钵液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2g‑0.4g的粉末迅速转移至液氮预冷的15mL离心管中，加入5mL提取缓冲液，充分混匀；（3）再加入2M 醋酸钠pH4.0，充分混匀；（4）加入5mL水饱和酚，颠倒混匀后再加入1mL氯仿，充分颠倒混匀，室温静置10min，4℃，10000×g离心10min；（5）将步骤（4）收集的上清转至新15mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，‑20℃沉淀至少1h；（6）4℃，3000×g离心10min，弃上清，得到RNA粗提物；（7）用2mL CES溶液重悬所得沉淀，用移液枪轻轻的吹打直至沉淀完全溶解；（8）加入2mL 氯仿，上下充分颠倒混匀再次抽提，室温静置10min，4℃，3000×g离心10min；（9）将步骤（8）所收集的上清液转移至新15mL离心管中，加入1/10体积的2M 醋酸钠溶液pH5.0和等体积的异丙醇，室温静置10min， 4℃，10000×g离心10min；（10）弃上清，用1mL 75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH2O溶解，DNaseI37℃下消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA；（11）消化结束后，加入1mL无水乙醇‑20℃沉淀20min， 4℃，10000×g离心10min；（12）弃上清，用1mL 75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH2O溶解，液氮速冻后‑80℃保存备用；所述CES缓冲液为：10mM 柠檬酸钠，1mM 乙二胺四乙酸，0.5% 十二烷基磺酸钠；所述提取缓冲液的配方为：4M 异硫氰酸胍，25mM 柠檬酸钠，0.5% 十二烷基肌氨酸钠，0.1M β‑巯基乙醇。 |
