猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用

摘要

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，涉及猪外周血单核淋巴细胞PD‑L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。通过采集猪外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；采用普通PCR扩增PD‑L1目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；将PD‑L1目的基因片段与pMD 18‑T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，按拷贝浓度绘制成标准曲线；根据荧光信号变化及标准曲线测出PD‑L1的基因丰度。本发明的猪PD‑L1基因丰度实时检测方法具有检测通量高、敏感性高、特异性强、操作简便、成本低及定量准确等优点。

主权项

猪外周血单核淋巴细胞PD‑L1实时荧光定量PCR 阳性标准重组质粒的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：采集仔猪的外周血，分离出外周血单核淋巴细胞，提取外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于‑20℃，采用普通PCR方法扩增PD‑L1目的基因片段；采用普通PCR方法扩增PD‑L1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将PD‑L1目的基因纯化片段与pMD 18‑T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；其中普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水；普通PCR反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min；其中，正向引物F 为：5′ ‑ AATGGCGAGGAAGACCTGAA ‑3′，反向引物R 为：5′ ‑ CAGCAGTAAACCCCTGCATCT ‑3′,所述目的基因片段为SEQ ID No.1；所述普通PCR 扩增时的反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。