一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法

摘要

一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，属于酶制剂、发酵技术领域。本发明将培养基优化和发酵过程控制组合优化，得出适合重组枯草芽孢杆菌培养方法；将重组枯草芽孢杆菌接入种子培养基后，摇床培养到对数生长期，接种一定量的种子液到调整后的发酵培养基中，用发酵罐进行发酵培养，每3h取样测定酶活力等参数。本发明采用组合优化的策略对重组枯草芽孢杆菌发酵产亮氨酸氨肽酶的条件进行了优化，将发酵培养基和发酵培养条件组合起来优化，使得重组枯草芽孢杆菌发酵产亮氨酸氨肽酶的能力得到了大幅度的提高，亮氨酸氨肽酶的酶活力达到605 U/mL。

主权项

一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于发酵罐发酵工艺具体步骤为：（1）种子液的制备：将‑40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；所述种子培养基为氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L；重组枯草芽孢杆菌，含连接了来源于枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5质粒，宿主菌Bacillus subtilis WB600；（2）发酵培养：将培养好的种子液以5％的量接种到7L发酵罐中，发酵罐的装液量为4L，通入无菌空气，搅拌转速250‑450rpm，通气比为1.2︰1，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30％，发酵培养30h；发酵培养过程的前12h的发酵培养温度为37℃，12h后发酵培养温度调整为30℃；发酵培养到15h时，一次性补加500g/L的葡萄糖补料液，使得发酵液中还原糖浓度为5g/L；所述发酵培养基为可溶性淀粉20 g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L，氯化钴0.6 mmol/L、用去离子水配制；产酶促进剂为：氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温‑80 2.4 mL/L；（3）参数测定：发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。