一种测定类凝血酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种蛇毒类凝血酶的测定方法，采用酶动力学测定法，使用可控温紫外分光光度计，经过考察孵育时间、酶浓度、线性范围以及该方法的精密度与酶促反应动力学常数，最终确立了蛇毒类凝血酶活力的测定方法。本发明克服了传统检测方法中存在的检测所用血浆或纤维蛋白原等原料性能差异大、操作人员主观影响大，以及只能专人负责测定等不利因素，具有步骤简单、不需做标准曲线、试验数据清晰明了，测定结果准确可靠的优点，适用于各种来源的类凝血酶原液和制剂的活性测定、活性定义，以及质量标准控制，包括天然及重组类凝血酶。

主权项

一种测定类凝血酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)用去离子水配制浓度为1‑2mM的生色底物水溶液，所述生色底物为S2238；(2)用20‑150mmol/L pH7.0‑8.0的Tris盐酸缓冲液或20‑150mmol/L pH7.0‑8.0的磷酸盐缓冲液稀释待测类凝血酶样品，得到样品浓度为18nmol/L‑100nmol/L的稀释液；(3)吸取步骤(2)制得的待测类凝血酶样品稀释液置于比色皿中，加入50μl的步骤(1)制得的生色底物水溶液，然后补充所述Tris盐酸缓冲液或磷酸盐缓冲液至终体积为1mL，混匀，使得待测类凝血酶样品的终浓度为1‑17nmol/L，于37℃静置2‑25分钟，然后在波长405nm处检测吸光度0‑20分钟，每30秒读数一次；(4)利用公式1计算所述待测类凝血酶样品的活力(U)：公式1：式中：U—活力单位，即产物生成速度(nmol/min)；ΔA—样品在反应时间中A405吸光度的变化值；V—反应体积(L)；1—光程(cm)；t—反应时间(min)；ξ—摩尔吸光系数，为10500(L/mol·cm)。