一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物及方法

摘要

本发明公开了一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR‑CTPP标记引物，包括外引物G³⁹³⁵‑TWF2和G³⁹³⁵‑TWR2；内引物G³⁹³⁵‑TNF2和G³⁹³⁵‑TNR2；本发明还公开了一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR‑CTPP标记方法，包括以下步骤：采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA；利用提取的DNA为模板进行特异性PCR扩增；将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。本发明使用四个引物结合一次PCR和电泳，便能在大麦群体中快速且经济地筛选出携带G³⁹³⁵突变为T位点的糯大麦材料，并能作为一种追踪标记在大麦苗期提前对杂交分离群体进行鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。

主权项

一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR‑CTPP标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：外引物G³⁹³⁵‑TWF2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’‑CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA‑3’；外引物G³⁹³⁵‑TWR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’‑CACTACAACAAGCGGCTATCT‑3’；内引物G³⁹³⁵‑TNF2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’‑TCGTGGAGGGCAAGATC‑3’；内引物G³⁹³⁵‑TNR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’‑GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC‑3’，上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基；所述的标记引物，具体按照以下步骤实施：步骤1、采用CTAB法提取大麦品种基因组DNA；步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定；所述步骤1中采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA具体按照以下步骤实施：步骤1.1、取100mg大麦的幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入预热至65℃的CTAB提取液700μL，混匀；65℃水浴40min，其间轻摇混匀数次；步骤1.2、冷却至室温后加入1mL体积比为24：1的氯仿：异戊醇，轻摇混匀10min，13000rpm离心10min；步骤1.3、取上清液，重复步骤1.2，取上清液加入700μL预冷至‑20℃的异丙醇，轻摇混匀后于‑20℃中静置2小时；步骤1.4、13000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀3次；晾干后加入100μL ddH₂O溶解；所述步骤2中特异性PCR反应体系如下：所述步骤2中的PCR反应程序为：PCR反应在PCR System 9700型PCR仪中进行；所述步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳40min后EB染色检测，如果扩增产物为861bp和552bp两种片段，显示标记个体基因型为TT型，为糯青稞，电泳条带为两条带；如果扩增产物为872bp和350bp两种片段，显示标记个体基因型为GG型，为普通青稞，电泳条带为两条带；如果扩增产物为861/872bp、552bp和350bp三条带；显示标记个体基因型为GT型，为普通青稞杂合型，电泳条带为三条带；所述CTAB提取液为2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris‑HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0。