一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其测试方法

摘要

本发明公开了一种采用磁微粒化学发光法测定中视黄醇结合蛋白(RBP)含量的试剂盒。试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；其中抗试剂异硫氰酸荧光素标记的视黄醇结合蛋白包被抗体和碱性磷酸酶标记的视黄醇结合蛋白标记抗体；磁微粒试剂为磁微粒与羊抗FITC连接物。本发明将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测灵敏度、精密性大大提高、检测范围扩大，反应时间大大缩短，从开始加样到检测结果，时间少于25min,明显快于同类试剂盒；并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现视黄醇结合蛋白的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。

主权项

一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到视黄醇结合蛋白的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解视黄醇结合蛋白抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na₂PO₃H·12H₂O、1～2g的NaPO₃H₂·12H₂O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4M HCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与视黄醇结合蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的视黄醇结合蛋白包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照视黄醇结合蛋白抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的视黄醇结合蛋白包被抗体；3)碱性磷酸酶与视黄醇结合蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的视黄醇结合蛋白抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，视黄醇结合蛋白抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：视黄醇结合蛋白＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的视黄醇结合蛋白标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的视黄醇结合蛋白包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的视黄醇结合蛋白标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂。