一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法

摘要

本发明公开了一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，取蓝藻水华区域的水样和室内培养微囊藻，进行RNA提取纯化，然后反转录得到cDNA，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。以引物gvpC扩增微囊藻伪空胞基因，以引物Micr特异性扩增微囊藻16srRNA内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，两者差值为校正后的细胞拷贝数，野外样品与室内样品的细胞拷贝数差值为野外目的基因相对循环数，记作ΔΔCt，采用2^‑ΔΔCt计算相对表达量，以时间为横坐标，2^‑ΔΔCt的值为纵坐标绘制曲线，根据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限。本方法可以同时对多个样品进行分析，其重复性好且准确，检测时间短。

主权项

一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于包括如下步骤：1）取发生蓝藻水华区域的水样，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本a；2）室内培养微囊藻，在对数生长期离心收集藻细胞，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本b；3）分别以RNA样本a和RNA样本b进行反转录得到cDNA‑a和cDNA‑b；4）以步骤3）得到的cDNA‑a作为荧光定量PCR的模板，以引物gvpC扩增微囊藻伪空胞基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{野外目的基因}；以引物Micr特异性扩增微囊藻16srRNA内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{野外同一样本16s}；两者差值Ct_{野外目的基因}‑Ct_{野外同一样本16s}为校正后的细胞拷贝数，记作ΔCt_{野外目的基因}；5）以步骤3）得到的cDNA‑b作为荧光定量PCR的模板，以引物gvpC扩增微囊藻伪空胞基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{室内目的基因}；以引物Micr特异性扩增微囊藻16srRNA内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{室内同一样本16s}；两者差值Ct_{室内目的基因}‑ Ct_{室内同一样本16s}为校正后的细胞拷贝数，记作ΔCt_{室内目的基因}；6）ΔCt_{野外目的基因}与ΔCt_{室内目的基因}差值为野外目的基因相对循环数，记作ΔΔCt，采用2^‑ΔΔCt计算相对表达量；7）取不同时间的水样重复上述步骤1）～6)，以时间为横坐标，步骤6）2^‑ΔΔCt的值为纵坐标绘制曲线，根据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限；其中：步骤2）中微囊藻为铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa） 7806；室内培养微囊藻的培养基为BG‑11，培养温度为28～35 ℃，光照强度为20～60 μE·(m²·s)^‑1，光照周期为9 h:15 h～12 h:12 h；步骤4）中所述引物gvpC序列为：gvpC‑F 5^′‑TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC‑3^′，gvpC‑R 5^′‑TCCTTCACCTGTTTGGCTCT‑3^′；引物Micr引物序列为：Micr184F 5^′‑GCCGCRAGGTGAAAMCTAA‑3^′，Micr431R 5^′‑AATCCAAARACCTTCCTCCC‑3^′。